Aislamiento de células endoteliales linfático humano por Multi-parámetro de clasificación de células activadas por fluorescencia

Summary

El objetivo de este protocolo es aislar las células endoteliales que recubren linfáticos malformación linfática buques y prepucios humanos como quistes utilizando células activadas por fluorescencia (FACS). Cultivo celular posterior y la expansión de estas células permite un nuevo nivel de sofisticación experimental para estudios genéticos, proteómicos, funcionales y diferenciación celular.

Abstract

Trastornos del sistema linfático, como el linfedema primario, malformaciones linfáticas y los tumores linfáticos son raras condiciones que causan morbilidad significativa pero poco se sabe sobre su biología. Aislamiento de células altamente puros humanos linfáticas endoteliales (LEC) de tejido enfermo y sano facilitaría estudios del endotelio linfático en los niveles genéticos, moleculares y celulares. Se prevé que estas investigaciones pueden revelar objetivos para nuevas terapias que pueden cambiar el manejo clínico de estas condiciones. Se presenta un protocolo que describe el aislamiento de prepucio humano LEC y las células endoteliales linfáticas malformación linfática (LM LECs). Para obtener una única suspensión de células de tejido se picó y se trató enzimáticamente usando dispasa II y colagenasa II. La suspensión de células única resultante se marcó con anticuerpos frente a grupo de diferenciación (CD) marcadores CD34, CD31, Vascular Endotelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) y podoplanin. STAIcélulas viables NED fueron ordenados en un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) para separar la población CD34 CD31 ^{Low Pos} VEGFR-3 ^{Pos Pos} podoplanin LM LEC de otras células no endoteliales endotelial y. Los LEC LM según se cultivaron y expandieron en frascos de fibronectina recubierto para uso experimental.

Introduction

Una función importante del sistema linfático vascular es la de absorber la linfa, un fluido intersticial que contiene el exceso de lípidos, proteínas y componentes celulares, y llevar a cabo al sistema venoso de la sangre. Una red de capilares linfáticos dirige la linfa a los ganglios linfáticos en el que se analiza para detectar la presencia de antígenos extraños, un proceso importante en la vigilancia y el despliegue de las células blancas de la sangre para neutralizar antígenos extraños inmunológico.

El sistema linfático unidireccional comienza en los tejidos con el capilar linfático inicial, una estructura única con una sola capa discontinua de células endoteliales planas de pared delgada con uniones de las células especializadas que permiten la entrada de la linfa ^1,2. Estos capilares están unidos a la matriz de tejido conectivo vecina a través de anclaje filamentos para evitar el colapso recipiente en presencia de aumento de la presión intersticial ^3. Los capilares linfáticos iniciales vacíos en la recogida de los capilares linfáticosque se unen en los vasos linfáticos o venas más grandes. En comparación con sus iniciales en vasos capilares linfáticos, la recogida de vasos linfáticos tienen más gruesas paredes de los vasos linfáticos, válvulas emparejadas y están encerradas por una membrana basal discontinua en la que unas pocas células musculares lisas se incrustan ^4. Coordinado apertura y cierre de las válvulas linfáticos y la contracción de las células musculares lisas facilita el flujo de la linfa ^3. En los seres humanos, las venas linfáticos de varias regiones del cuerpo se unen para formar troncos linfáticos que se fusionan para formar dos conductos linfáticos: conducto torácico y el conducto linfático derecho. El conducto torácico drena linfa desde el lado izquierdo del cuerpo y desde el lado derecho debajo del pecho mientras que la derecha linfático drena conducto linfático desde el brazo derecho y el lado derecho de la cabeza, el cuello y el tórax. Ambos conductos conducen la linfa en las venas subclavia en el cuello ^5.

Trastornos del sistema linfático se agruparse en una adquiridand congénita (Tabla 1). Ejemplos de condiciones adquiridas son linfangitis y linfedema secundario. La linfangitis es una inflamación de un vaso linfático debido a la infección bacteriana. Los linfáticos afectados se dilatan y se llenan de exudado que contiene células polimorfonucleares. En la piel, estos vasos linfáticos son visibles como rayas rojo subcutánea, dolorosa a menudo acompañada por la ampliación del nodo asociado drenaje linfático (linfadenitis) ^6. El linfedema secundario surge como consecuencia de daños o obstrucción al recipiente o de los ganglios linfáticos obstrucción linfática. Esto conduce a la inflamación crónica progresiva debido a la acumulación de linfa distal al daño u obstrucción. En los países desarrollados, el linfedema secundario es más comúnmente asociado con la malignidad en tumores metástasis obstruyen los vasos linfáticos o ganglios linfáticos regionales, o como consecuencia de la terapia contra el cáncer después de la extirpación quirúrgica de los ganglios linfáticos, la fibrosis después de la irradiación y Throm post-inflamatoriaBosis y cicatrización ^7. En otras partes del mundo, el linfedema secundario puede ser secundaria a obstrucción linfática causada por gusanos parásitos tales como Wuchereria bancrofti ^6.

Trastornos del sistema linfático vascular
Adquirido	Congénito
La linfadenitis El linfedema secundario	Primaria linfedema 10	Esporádicos malformaciones linfáticas 13	Linfático malformaciones asociadas con síndromes 13
	por ejemplo, Síndrome de Milroy Síndrome de Meige	Sencillo: Malformaciones linfáticas	por ejemplo, Síndrome de Klippel-Tranaunay Weber Parques Síndrome de Sturge-Weber
		Combinado: Malformaciones capilares linfáticos Malformación capilar-linfático-venosa Malformación capilar-linfático-arteriovenosa Malformación venosa-arteriovenosa-capilar linfático

Tabla 1. Descripción general de los trastornos del sistema vascular linfático.

Trastornos congénitos del sistema linfático incluyen el linfedema primaria (idiopática) pensado para ser causada por mutaciones genéticas, linfangiectasia y anomalías del sistema linfático ^8,9. El linfedema primario puede ser esporádica, presumiblemente causada por mutaciones de novo o heredada. Trastornos linfáticos también pueden ser aislados o comprender parte de un síndrome más generalizada ^10. En la población pediátrica, el 97% de la linfaEl edema es esporádico con anormalidades en la estructura de los vasos linfáticos que deterioran el drenaje linfático regional ^11. Enfermedad de Milroy es un ejemplo de linfedema primario causado por una mutación en el gen evidente al nacer o poco después del ¹² de VEGFR-3. Aunque la mayoría de condición familiar, la enfermedad de Milroy también se puede identificar en los lactantes sin antecedentes familiares de la enfermedad de Milroy ^32. La gravedad de cualquier linfedema es dependiente de la cantidad de producción de linfa y la capacidad de transporte linfático de nuevo a la circulación venosa ^6.

Basado en la presentación clínica y en la proliferación de células endoteliales in situ, anomalías del sistema linfático se clasifican como tumores linfáticos o malformaciones linfáticas ^13. Kaposiforme linfangiomatosis es un ejemplo de un tumor LEC ^14. Malformaciones linfáticas se cree que surgen durante el desarrollo embrionario y crecer en proporción con el niño ^15,16. Ellos rara vez regresan, pero pueden REMAIn asintomática hasta un trauma o infección precipitados rápido crecimiento que conduce a complicaciones clínicas. La estructura ordenada de la red linfática y la conducción de la linfa de los tejidos a la circulación venosa descrito anteriormente es perturbado en malformaciones linfáticas que consisten en colecciones localizadas de estructuras quísticas anormales llenos de líquido linfático. Si bien no hay evidencia clínica o experimental que estos vasos quísticas están conectados a la circulación linfática o que contienen válvulas linfáticos funcionales, su identidad linfático se confirma por la expresión de gama de marcadores de células linfáticas, tales como podoplanin, CD31, linfático Embarcación endotelial Receptor 1 (LYVE-1), proteína homeobox Prospero 1 (PROX-1) y VEGFR-3 ^15,17,18. Estas estructuras quísticas pueden ser pequeña (microquística) o grandes (macroquístico), pero la mayoría de las malformaciones linfáticas contener tanto microquística y componentes macroquísticas (Figura 1) ^16. Después de la cirugía, injection escleroterapia y / o Ablación por Radiofrecuencia las malformaciones linfáticas menudo reaparecen.

Figura 1. Morfología de los vasos linfáticos humanos y malformaciones linfáticas. Linfático humano normal (A) y los vasos linfáticos malformación (B y C) marcadas con anticuerpo para podoplanin (etiqueta marrón, flecha). Vasos malformación linfática Humanos se caracterizan por la dilatación marcada y una considerable variación en el tamaño del lumen. Estas estructuras quísticas anormales localizadas pueden ser pequeña (microquística, *) (B) o grandes (macroquístico, #) (C). La mayoría de las malformaciones linfáticas contienen componentes microquísticas y macroquísticas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura. </ P>

Algunos investigadores han sugerido que las malformaciones linfáticas representan un trastorno del desarrollo de la vasculatura linfática en el que los LECs no tienen potencial de crecimiento anormal, pero han fracasado en lugar de conectarse a la circulación normal ^19. Sin embargo, hemos encontrado que los LECs LM proliferan más rápido y son más resistentes a la apoptosis de prepucio LEC ¹⁵ que sugiere que hay un defecto primario en el LM LEC. Cuando LM LEC se implantan en un modelo de xenoinjerto de ratón, forman estructuras que recuerdan a las malformaciones linfáticas ^15. Esto apoya la hipótesis de que las malformaciones linfáticas pueden ser causados ​​por una o más mutaciones somáticas que surgen en LM LEC durante el desarrollo fetal. En efecto, informes recientes han identificado uno de tales mutación en la subunidad catalítica p110α de fosfoinositida-3-quinasa (PIK3CA) gene ^20.

Teniendo en cuenta los avances en la tecnología de secuenciación de ADN, mutaciones pertinentes could ser identificados más fácilmente en aislados LM LEC, guiando los estudios futuros de estas condiciones. El aislamiento de los LEC viables facilitaría las comparaciones entre los LEC anormales y normales en ensayos tales como la migración, la proliferación, la capacidad de formación de tubo y la supervivencia en respuesta a la disponibilidad de nutrientes reducida o agentes pro-apoptóticos ^15. LEC aislados nos permitirían además de realizar la expresión génica de células específicas y estudios proteómicos, para delinear nuevas subpoblaciones LEC y descubrir nuevos agentes farmacológicos adecuados para el manejo clínico de las malformaciones linfáticas.

Hemos publicado previamente un método de aislamiento LEC basada en la separación de cuentas magnéticas de LEC de prepucio neonatal y malformaciones linfáticas ^15. Hemos informado una estrategia de separar los LEC normales y enfermos de las células endoteliales vasculares en base a la ausencia de expresión de CD34, seguido de someter la fracción de células CD34 ^Neg a la selección positiva para CD31.Sin embargo, este método se ve obstaculizada por la presencia de células no endoteliales residuales. Esto era independiente de la eliminación de la epidermis antes de la posterior digestión del tejido conectivo. Estos contaminantes generalmente proliferan más rápidamente y por lo tanto el tiempo overgrew los cultivos de células endoteliales a pesar de los intentos posteriores para repetir el aislamiento LEC. De hecho, una contaminación inicial de células no endoteliales tan bajas como 2% a 5% era suficiente para saturar la población LEC ^15. Esto nos llevó a explorar método de clasificación de células con fluorescencia activado como una opción para mejorar el rendimiento de células LEC y pureza. Además, se utilizó multi-parámetro de clasificación para mejorar la especificidad de las poblaciones de LEC, añadiendo VEGFR-3 y podoplanin a los marcadores de selección para identificar CD34 CD31 ^{Low Pos} VEGFR-3 ^{Pos Pos} podoplanin LEC.

La razón para la selección de estos marcadores se basa en los informes que mientras ce LEC y vascular endotelial sangreLLS tener muchos marcadores de superficie celular en común, tales como CD31, LEC mostrar la variación fenotípica en su expresión de CD34, podoplanin y VEGFR-3 marcador de superficie celular en comparación con las células endoteliales vasculares sanguíneos ^21-23. CD31 es una glicoproteína transmembrana de 130 kDa también conocido como plaquetas molécula de adhesión celular endotelial 1 (PECAM-1). Se considera que es un marcador de células pan-endotelial, ya que se expresa en todos los tipos de vasos sanguíneos y linfáticos ^21,24,25. CD34 es 110-kDa glicoproteína transmembrana presente en más progenitor hematopoyético y las células, las células endoteliales vasculares y algunos vasos linfáticos ²⁶ del vástago.

VEGFR-3, el receptor para el crecimiento endotelial vascular factores de C y D, está presente inicialmente en las venas en desarrollo en el embrión de ratón, pero siguiente especificación linfático regulado por los factores de transcripción de la HMG-box relacionados con SRY (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f actor de 2 (COUPTF-II) y PROX-1, VEGFR-3 de expresión venosa se ​​pierde y se restringe a embrionaria LEC ^25,27. Podoplanin, una membrana 38 kDa mucoproteína, se observó por primera vez en los vasos linfáticos en aproximadamente embrionarias día 11 (~ E11.0) del desarrollo embrionario del ratón ²⁸ y mientras que se expresa fuertemente por los vasos linfáticos microvasculares, podoplanin expresión por endotelio linfático macroquístico en malformaciones linfáticas es más variable ^15. La citometría de flujo experimentos sugieren que al menos algunas células endoteliales CD34 CD31 ^{de alta Pos} expresan el marcador linfático podoplanin ^29. Aunque la evaluación sistemática de tinción LYVE-1 y podoplanin en malformaciones linfáticas humanos mostró que ambos son eficaces en la tinción del endotelio linfático malformación ^30, en tejidos normales, se informó LYVE-1 para ser fuertemente presente en el linfático inicialendotelio capilar pero redujo e incluso ausente en el endotelio linfático recolectar ^31. Como nuestro objetivo es aislar tanto las células endoteliales linfáticas iniciales y de recogida que hemos optado por no utilizar LYVE-1 como parte de nuestra estrategia de selección de celda. Finalmente, la decisión de emplear estos marcadores también se basa en la disponibilidad de anticuerpos que se utilizan para el diagnóstico para el etiquetado de los vasos linfáticos para imágenes microscópicas, una característica que permita correlación entre la citometría de flujo y estudios de inmunofluorescencia.

En este artículo se describirá el método de digestión de tejido, tinción de células y la configuración de FACS requerido para el aislamiento con éxito de CD34 CD31 ^{Low Pos} VEGFR-3 ^{Pos Pos} podoplanin LEC así como las células endoteliales CD34 CD31 ^{de alta Pos} VEGFR-3 ^{Pos Pos} podoplanin de prepucio y malformación linfática tejido.

Protocol

Declaración de Ética: La aprobación ética para la recogida de tejidos de malformación y prepucio linfáticos se obtuvo de los Comités Éticos de Investigación Humanos del Hospital Royal Children de Melbourne, Australia. Firmado el consentimiento se recibió de los padres de los pacientes antes de la cirugía. Las muestras de tejido se obtuvieron de pacientes con diagnóstico de LM sometidos a procedimientos quirúrgicos como parte de su manejo clínico y los pacientes sometidos a la circuncisión electiva. Todos …

Representative Results

Después de la digestión inicial del tejido, después de 24 horas en cultivo de muestras no fraccionadas, las colonias de células endoteliales se pueden observar distintas (Figura 2A) junto con células similares a fibroblastos y células musculares lisas. Después de la clasificación y después de 24 horas en cultivo celular, las células CD34 CD31 Low Pos VEGFR-3 células Pos Pos Podoplanin adjuntar y mostrar la morfología de adoquín típica (Figura 2B y <st…

Discussion

LEC juegan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de fluidos, la respuesta inmune a los antígenos extraños y la absorción y el transporte de algunos nutrientes. Homeostasis LEC puede verse afectada por los procesos de enfermedad, tales como infecciones bacterianas y la metástasis del tumor, pero los LEC también se puede desarrollar mutaciones somáticas que resultan en la formación de vasos linfáticos disfuncionales y morbilidad significativa para los pacientes afectados. Para obtener una mayor…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalogue Number	Description
DMEM	Life Technologies (Gibco)	11965-092	Used to collect tissue samples from the operating theatre.
EGM-2 MV Bullet Kit	Lonza	CC-3202	EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.
VEGF-C	R&D Systems	2179-VC-025	Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C
Antibiotic-antimycotic solution (100x)	Life Technologies (Gibco)	15240-062	This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F2006	Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.
StemPro Accutase Cell dissociation reagent	Life Technologies (Gibco)	A11105-01	StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.
0.4% Trypan Blue dye	Life Technologies (Gibco)	15250-061	Used as a viability stain.
Dispase II	Roche Applied Biosciences	4942078001	Used at 0.04%
Collagenase II	Worthington Lab	4176	Used at 0.25%
DNase I	Roche Applied Biosciences	11284932001	Used at 0.01%
70 mm nylon cell strainers	BD Falcon	352350
PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59	BioLegend	356204	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581	BioLegend	343516	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59	BioLegend	303116,	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.	BioLegend	337006	Used at 1:200 dilution
PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400112	Used at 1:50 dilution
PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400126	Used at 1:200 dilution
APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400120	Used at 1:100 dilution
Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758	BioLegend	400525	Used at 1:200 dilution