Isolering av Human Lymphatic endotelceller från Multi-parameter fluorescensaktiverad cellsortering
Summary
Målet med detta protokoll är att isolera lymfatiska endotelceller kantar mänskliga lymfatiska missbildning cysta-liknande fartyg och förhud som använder fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Efterföljande cellodling och expansion av dessa celler möjliggör en ny nivå av experimentell förfining för genetiska, proteomik, funktionella och celldifferentiering studier.
Abstract
Lymfsystemet såsom primära lymfödem, lymfatiska missbildningar och lymfatiska tumörer är sällsynta sjukdomar som orsakar betydande sjuklighet men lite är känt om deras biologi. Isolera mycket rena mänskliga lymfatiska endotelceller (LECS) från sjuka och frisk vävnad skulle underlätta studier av det lymfatiska endotel på genetiska, molekylära och cellulära nivåer. Det förväntas att dessa undersökningar kan avslöja mål för nya behandlingar som kan förändra den kliniska hanteringen av dessa villkor. Ett protokoll som beskriver isolering av human förhud LECS och lymfatiska missbildning lymfatiska endotelceller (LM LECS) presenteras. För att få en enda cell suspension vävnad malet och enzymatiskt behandlas med dispase II och kollagenas II. Den resulterande enkelcellsuspension märktes sedan med antikroppar mot kluster av differentiering (CD) markörer CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) och PODOPLANIN. Stainierade viabla celler sorterades på en fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) för att separera CD34 Låg CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LM LEC befolkningen från andra endotel- och icke-endotelceller. De sorterade LM LECS odlades och expanderat på fibronektinbelagda flaskor för ytterligare experimentell användning.
Introduction
En viktig funktion hos det lymfatiska kärlsystemet är att absorbera lymfa, ett överskott interstitiell fluid innehållande lipider, proteiner och cellulära komponenter, och föra den till blod vensystemet. Ett nätverk av lymfkapillärer styr lymfan till lymfkörtlarna där det screenas för närvaron av främmande antigener, en viktig process i immun övervakning och spridning av vita blodkroppar för att neutralisera främmande antigen.
Den enkelriktade lymfatiska systemet startar i vävnader med den initiala lymfatiska kapillär, en unik struktur med diskontinuerligt enda skikt av tunnväggiga plana endotelceller med specialiserade cellföreningspunkter som tillåter lymfa inträde 1,2. Dessa kapillärer är fastade till den angränsande bindvävs matrisen via förankringsfilament för att förhindra kärlkollaps i närvaro av ökad interstitiell tryck 3. De första lymfkapillärer tomma till att samla lymfatiska kapillärersom smälter samman till större lymfkärl eller vener. I jämförelse med initial lymfatiska kapillärkärl, samla lymfkärl har tjockare kärlväggarna, parade lymfatiska ventiler och är inneslutna av ett diskontinuerligt basalmembran där några glatta muskelceller är inbäddade 4. Samordnad öppning och stängning av lymfatiska ventiler och kontraktion av glatta muskelceller underlättar flödet av lymfa 3. Hos människa, det lymfatiska vener från olika delar av kroppen förenas för att bilda lymfatiska stammar som slår sig samman för att bilda två lymfvägarna: bröstgången och rätten lymfatiska kanalen. Den lymfgången tömmer lymfan från den vänstra sidan av kroppen och från höger sida under bröstet medan den högra lymfatiska kanal avlopp lymfa från höger arm och höger sida av huvudet, halsen och bröstkorgen. Båda kanalerna genomföra lymfan i subclavia venerna i nacken 5.
Sjukdomar i det lymfatiska systemet är i stort sett delas in i förvärvat ennd kongenital (tabell 1). Exempel på förvärvade villkor är lymfangit och sekundära lymfödem. Lymfangit är en inflammation i en lymfatiska kärl på grund av bakteriell infektion. De drabbade lymfkärlen vidgas och fyll med exsudatceller innehåller polymorfonukleära celler. I huden, dessa lymfkärlen syns som röda, smärtsamma subkutana streck ofta åtföljs av utvidgningen av den tillhörande dränerande lymfkörteln (lymfadenit) 6. Sekundär lymfödem uppstår som en följd av skada eller hinder för det lymfatiska kärl eller lymfkörtlar obstruktion. Detta leder till kronisk progressiv svallning på grund av ansamling av lymfa distalt skadan eller obstruktion. I utvecklade länder, är sekundär lymfödem oftast förknippas med malignitet där metastaserande tumörer hindrar lymfkärl eller regionala lymfkörtlar, eller som en följd av anti-cancerterapi efter kirurgiskt avlägsnande av lymfkörtlar, efter bestrålning fibros och post-inflammatoriska Thrombosis och ärrbildning 7. I andra delar av världen, kan sekundär lymfödem vara sekundärt till lymfatiska obstruktion orsakas av parasitmaskar som Wuchereria bancrofti 6.
| Sjukdomar i det lymfatiska kärlsystemet | |||
| Förvärvat | Medfödd | ||
| Lymfadenit Sekundär lymfödem | Primär lymfödem 10 | Sporadiska lymfatiska missbildningar 13 | Lymfatiska missbildningar associerade med syndrom 13 |
| t.ex Milroy syndrom Meige syndrom | Enkel: Lymfatiska missbildningar | t.ex Klippel-Tranaunay syndrom Parker Weber syndromet Sturge-Weber syndromet | |
| Kombinerad: Kapillärliknande lymfatiska missbildningar Kapillär-lymfatiska-venös missbildning Kapillär-lymfatiska-arteriovenös missbildning Kapillär-lymfatiska venös-arteriovenös missbildning | |||
Tabell 1. Översikt över störningar i lymfatiska kärlsystemet.
Medfödda störningar i det lymfatiska systemet inkluderar primär (idiopatisk) lymfödem tros vara orsakad av genetiska mutationer, lymphangiectasia och anomalier i lymfsystemet 8,9. Primär lymfödem kan vara sporadisk förmodligen orsakats av de novo mutationer, eller ärvt. Lymfsystemet kan också vara isolerade eller utgör en del av en mer generell syndrom 10. I den pediatriska populationen, 97% av lymfaödem är sporadisk med avvikelser i lymfkärl struktur som försämrar den regionala lymfdränage 11. Milroy sjukdom är ett exempel på primära lymfödem orsakas av mutation i VEGFR-3-genen uppenbar vid födseln eller strax efter 12. Även om det mesta familjär tillstånd kan Milroy sjukdomen också identifieras hos spädbarn utan familjehistoria av Milroy sjukdom 32. Svårighetsgraden av någon lymfödem beror på mängden av lymfa produktion och förmåga att transportera lymfa tillbaka till venösa cirkulationen 6.
Baserat på kliniska och in situ endotelcellförökning är avvikelser i det lymfatiska systemet klassificeras som lymfatiska tumörer eller lymfatiska missbildningar 13. Kaposiform lymphangiomatosis är ett exempel på en LEC-tumör 14. Lymfatiska missbildningar tros uppstå under fosterutvecklingen och växa i proportion till barnet 15,16. De tillbaka sällan men kan remain asymtomatisk tills trauma eller infektion fällningar snabb tillväxt leder till kliniska komplikationer. Ordnad struktur lymfatiska nätverk och ledning av lymfa från vävnaden till venösa cirkulationen beskrivits ovan störs i lymfatiska missbildningar som består av lokala samlingar av onormala cystisk strukturer fyllda med lymfvätska. Medan det finns inga kliniska eller experimentella bevis för att dessa cystisk fartyg är anslutna till det lymfatiska cirkulationen eller att de innehåller funktionella lymfatiska ventiler, är deras lymfatiska identitet bekräftas genom expression av olika lymfatiska cellmarkörer såsom PODOPLANIN, CD31, lymfkärl endotelreceptor 1 (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) och VEGFR-3 15,17,18. Dessa cystiska strukturer kan vara antingen små (microcystic) eller stor (macrocystic), men de flesta lymfatiska missbildningar innehåller både microcystic och macrocystic komponenter (figur 1) 16. Efter kirurgi, injection sclerotherapy och / eller radiofrekventa ablation det lymfatiska missbildningar ofta upprepas.
Figur 1. Morfologi av mänskliga lymfkärl och lymfatiska missbildningar. Normal human lymfatiska (A) och lymfatiska missbildnings fartyg (B och C) märkta med antikroppar mot PODOPLANIN (brun etikett, pil). Mänskliga lymfatiska missbildnings fartyg kännetecknas av markant utvidgning och stor variation i lumen storlek. Dessa lokaliserade abnorma cystiska strukturer kan vara antingen små (microcystic, *) (B) eller stora (macrocystic, #) (C). De flesta lymfatiska missbildningar innehåller både microcystic och macrocystic komponenter. Klicka här för att se en större version av bilden. </ P>
Vissa forskare har föreslagit att lymfatiska missbildningar utgör en utvecklingsstörning av lymfatisk kärl där LECS inte har onormal tillväxtpotential utan har misslyckats med att ansluta till den normala cirkulationen 19. Emellertid har vi funnit att de LM LECS prolifererar snabbare och är mer resistenta mot apoptos än förhud LECS 15 tyder på att det är en primär defekt i LM LECS. När LM LECS implanteras i en mus xenograftmodell bildar de strukturer som påminner om lymfatiska missbildningar 15. Detta stöder en hypotes som lymfatiska missbildningar kan orsakas av en eller flera somatiska mutationer uppstår i LM LECS under fosterutvecklingen. I själva verket har nya rapporter identifierat en sådan mutation i p110α katalytiska subenheten av fosfoinositid-3-kinas (PIK3CA) gen 20.
Med tanke på de framsteg inom DNA-sekvenseringsteknologi, relevanta mutationer cOuld vara lättare identifieras i isolerade LM LECS, vägleda framtida studier av dessa villkor. Isoleringen av livskraftiga LECS skulle underlätta jämförelser mellan onormala och normala LECS i analyser som migration, proliferation, rör bildningsförmåga och överlevnad som svar på minskad närings tillgänglighet eller pro-apoptotiska medel 15. Isolerade LECS skulle ytterligare underlätta för oss att utföra cellspecifika genuttryck och proteomik studier, för att beskriva nya LEC subpopulationer och upptäcka nya farmakologiska medel som är lämpliga för klinisk behandling av lymfatiska missbildningar.
Vi har tidigare publicerat en LEC isoleringsmetod baserad på magnetisk pärla separation av LECS från neonatal förhud och lymfatiska missbildningar 15. Vi rapporterade en strategi för att separera normala och sjuka LECS från vaskulära endotelceller som bygger på frånvaro av CD34 uttryck, följt av att utsätta CD34 Neg cellfraktionen till positiv selektion för CD31.Emellertid var denna metod hämmas av närvaron av kvarvarande icke-endotelceller. Detta var oberoende av avlägsna epidermis före efterföljande bindväv matsmältningen. Dessa föroreningar frodats i allmänhet snabbare och därmed så småningom växte över de endothelial cellkulturer trots efterföljande försök att upprepa LEC isolering. Faktum är en initial förorening av icke-endotelceller så låga som 2% till 5% var tillräcklig för att överväldiga LEC befolkningen 15. Detta fick oss att utforska fluorescerande aktiverad cellsortering metod som ett alternativ för att förbättra LEC cellutbyte och renhet. Dessutom använde vi flera parametrar sortering för att förbättra specificiteten hos LEC populationer, lägga VEGFR-3 och PODOPLANIN till urvals markörer för att identifiera CD34 Låg CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LECS.
Skälet till att välja dessa markörer baserades på de rapporter som samtidigt LECS och blod vascular endothelial cells har många cellytmarkörer gemensamt såsom CD31, LECS visar fenotypisk variation i sitt uttryck av CD34, PODOPLANIN och VEGFR-3 cellytmarkör jämfört med blod kärlendotelceller 21-23. CD31 är ett 130 kDa transmembran glykoprotein även känd som trombocyt endotelial celladhesionsmolekyl 1 (PECAM-1). Det anses vara en pan-endotelceller markör eftersom det uttrycks på alla typer av blod och lymfkärl 21,24,25. CD34 är 110 kDa transmembran glykoprotein närvarande på de flesta hematopoietiska progenitor och stamceller, vaskulära endotelceller och vissa lymfkärlen 26.
VEGFR-3, receptorn för vaskulär endotelial tillväxtfaktorer C och D, är initialt närvarande på utvecklings venerna i musembryo, men efter lymfatisk specifikation regleras av transkriptionsfaktorer SRY-besläktad HMG-box (SOX) -18, c hicken o valbumin u pstream p romoter t ranscription f skådespelare 2 (COUPTF-II) och PROX-1, är VEGFR-3 venös uttryck förlorat och det blir begränsad till embryonal LECS 25,27. PODOPLANIN en kDa membran 38 mukoprotein, först noteras på lymfkärl till cirka embryonala dag 11 (~ E11.0) av mus embryonal utveckling 28 och samtidigt som det är starkt uttryckt av mikrovaskulära lymfkärl, PODOPLANIN uttryck genom macrocystic lymfatiska endotel i lymfatiska missbildningar är mer varierande 15. Flödescytometri experiment antyder att åtminstone några CD34 Hög CD31 Pos endotelceller uttrycker det lymfatiska markör PODOPLANIN 29. Även om systematisk utvärdering av LYVE-1 och PODOPLANIN färgning i mänskliga lymfatiska missbildningar visade att både är effektiva vid färgning lymfatiska missbildning endotel 30, i normala vävnader, LYVE-1 rapporterades vara starkt närvarande i den initiala lymfatiskakapillärendotelet men minskas och även frånvarande i uppsamlings lymfatiska endotel 31. Eftersom vårt mål är att isolera både de ursprungliga och samla lymfatiska endotelceller vi har valt att inte använda LYVE-1 som en del av vårt utbud cell strategi. Slutligen, beslutet att använda dessa markörer ades också på att det finns antikroppar som används diagnostiskt för att märka lymfkärl för mikroskopisk avbildning, en funktion som skulle möjliggöra korrelation mellan flödescytometri och immunofluorescerande studier.
Denna artikel kommer att beskriva vävnads digestionsmetoden, cellfärgning och FACS inställningar som krävs för framgångsrik isolering av CD34 Låg CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos LECS liksom CD34 hög CD31 Pos VEGFR-3 Pos PODOPLANIN Pos endotelceller från förhuden och lymfatiska missbildning vävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
LECS spelar en viktig roll för att upprätthålla vätske homeostas, immunsvar mot främmande antigener och absorption och transport av vissa näringsämnen. LEC homeostas kan påverkas av sjukdomsprocesser såsom bakteriella infektioner och tumörmetastaser, men LECS kan också utveckla somatiska mutationer som leder till bildandet av dysfunktionella lymfkärl och hög sjuklighet för drabbade patienter. För att få mer förståelse för lymfatiska missbildning etiologi genom implantation in vivo och ex …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka för Baker Foundation och Kungliga Barnens stiftelsens Kvinnor och vetenskap Fellowship "stöd för Zerina Lokmic. Andrew G. Elefanty och Edouard G. Stanley är NHMRC Senior Research Fellow. Arbetet i sina laboratorier stöddes av NHMRC och stamceller Australien.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalogue Number | Description |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 | |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
References
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).
- Zawieja, D. C. Contractile physiology of lymphatics. Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).
- Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).
- Andrade, M., Jacomo, A. Anatomy of the human lymphatic system. Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).
- Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. . Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, (2009).
- Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).
- . . Mulliken & Young’s Vascular Anomalies Hemangiomas and. , 1059-1076 (2013).
- . . Mulliken & Young’s Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, 562-594 (2013).
- Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
- Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).
- Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. Genetics of lymphatic anomalies. J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).
- . for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).
- Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).
- Smith, R. J. Lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).
- Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).
- Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).
- Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. Vascular malformations. Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).
- Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. . 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , (2014).
- Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).
- Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).
- Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
- Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).
- Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).
- Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).
- Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).
- Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).
- Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).
