En standardiseret metode til analyse af Liver Sinusformet endotelceller og deres fenestrationer af Scanning Electron Microscopy
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
De lever sinusformede endotelceller (LSECs) er stærkt differentierede endotelceller denne linje væggen i hepatisk sinusoid. LSECs er perforeret med fenestrationer, som er ikke-diaphragmed, transcellulær porer 50-250 nm i diameter. Op til 20% af overfladen af LSECs er dækket af fenestrationer, som normalt i grupper af ti til hundrede kaldet sieve plader 1-3 (figur 1). Fenestrationer muliggøre overførsel af plasma og nanosubstrates mellem blod og hepatocytter, hvilket skaber en yderst effektiv ultrafiltrering system. Fenestrationer er dynamiske strukturer – både deres størrelse og / eller nummer kan ændres som reaktion på forskellige fysiologiske tilstande, narkotika og sygdom. For eksempel fenestrationer er større i fastende end i fastende tilstand 4; 2-di-iodoamphetamine øger fenestration nummer, 5,6 og en reduktion i størrelsen og antallet af fenestrationer per celle forekommer i aldring og mange sygdomstilstande 7-13 </sup>. Nøjagtig måling af størrelsen og antallet af fenestrationer er vigtig for at forstå, hvordan LSEC morfologi påvirkes af forskellige sygdomme, giftige, og fysiologiske tilstande; deres indvirkning på leverfunktionen; og for udvikling fenestration-modulerende terapeutiske interventioner 1.
Studiet af fenestrationer er vanskelig. Diameteren af fenestrationer ligger under løsningen af konventionel lysmikroskopi, så hidtil eneste observation under anvendelse af elektronmikroskopi både i intakte lever væv eller dyrkede LSECs har været muligt. Scanning elektronmikroskop (SEM) er oftest blevet anvendt til at undersøge fenestration størrelse, frekvens og porøsitet (procentdelen af LSEC membran, der er perforeret af fenestrationer), fordi SEM muliggør observation af store områder af endoteloverfladen og måling af tusinder, hvis ikke titusinder af fenestrationer. På trods af sin nytte, de resultater, der er rapporteret fra SEM-baserede undersøgelser forLSEC parametre som vindues størrelse, antal, hyppighed og porøsitet varierer meget i litteraturen (tabel 1).
Fenestrationer og si plader er skrøbelige strukturer, kontrakt, bryde, spile eller flyder sammen under prøven forberedelse, er der behov derfor omhyggelig behandling for at bevare deres integritet. Forhøjet perfusionstryk 14; ukorrekt osmolaritet af fiksativ og buffere 15; utilstrækkelig fiksering eller fiksering tid; og hastigheden af post-fiksering dehydrering og tørring er alle områder af behandling til SEM, der kan producere artefakter, som interfererer med bevarelse af ultrastruktur (figur 2). Tab af fenestrationer (defenestration «) og fenestration krympning kan forekomme som et resultat af dårlig fiksering, hvilket resulterer i reduceret fenestration diameter og celle porøsitet. Metoder til forbedring af bevarelsen af enheder til SEM-analyse er blevet beskrevet tidligere 15-17 og vil blive drøftether med yderligere tips om hvordan man kan forbedre modellen konservering. De vigtigste mål for prøven konservering er at fjerne blod fra sinusoids så overfladen af LSEC kan visualiseres og undgå LSEC skader fra enten højt tryk eller forsinket fiksering. Hel lever perfusion af fiksativ på portalen vene er den foretrukne metode til leveren fiksering. Som beskrevet nærmere andetsteds 16,18 perfusion skal foretages ved lavt tryk (f.eks 10 cm H 2 0) for at undgå tryk-relateret perfusion artefakter og skader på LSEC, typisk manifesteret som store huller inden i cellemembranen. Imidlertid kan rimelig fiksering ofte opnås ved anvendelse nål perfusion af leverbiopsier fra mennesker og dyr, som beskrevet detaljeret andetsteds 19. Denne teknik indebærer direkte indsprøjtning fiksativ i vævet, indtil blodet skylles ud af prøven, og vævet er fast og fast. Fiksering af prøver til elektronmikroskopi skal være performed så hurtigt som muligt efter ophør af blodgennemstrømning at forhindre ultrastrukturelle forandringer som følge af leverne ekstremt hurtige autolytiske processer.
Vi præsenterer også en fremgangsmåde til billedanalyse, der minimerer optagelsen af artefakter, og standardiserer målingen af fenestrationer. Variation i udvælgelsen af sinusoids for mikrografier, billedanalyse af artefakter, og måling af celle område for porøsitet og fenestration frekvens har ført til store forskelle i offentliggjorte resultater. En standardiseret metode til evaluering og måling af fenestrationer og minimumskravene for datapræsentation er ikke blevet tydeligt behandlet i litteraturen tidligere 4,10,20-31.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evnen til nøjagtigt og reproducerbart måle status for leveren sinusformede endotel er et vigtigt skridt i forståelsen af biologien for disse højt specialiserede celler. Nyere teknikker såsom struktureret belysning mikroskopi 32, atomic force mikroskopi 33 og d-STORM (direkte Stochastic Optical reconstrucion Microscopy) 34 vil give vigtige oplysninger om morfologi af disse celler in vitro, men SEM er fortsat den primære metode til at visualisere og måle deres struktu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
References
- Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., Arias, I. M. . The Liver: Biology and Pathobiology. , 387-404 (2009).
- Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
- Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
- Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
- Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
- Le Couteur, D. G., Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. . Calorie Restriction, Aging and Longevity. , 191-216 (2010).
- McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
- Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
- Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
- Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
- Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
- Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
- Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
- Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
- Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
- Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
- Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
- May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).
- Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
- Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
- Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
- Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
- Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
- Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
- Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
- Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
- Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
- Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
- Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).
