Un metodo standardizzato per l'analisi delle cellule epatiche sinusoidali endoteliali e loro fenestrazioni da microscopia elettronica a scansione
Summary
The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Abstract
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Introduction
Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) sono altamente cellule endoteliali differenziate che rivestono la parete della sinusoide epatica. LSECs sono perforate con finestrature che non sono diaframmato, transcellulare pori 50-250 nm di diametro. Fino al 20% della superficie di LSECs è coperto da fenestrations, che sono di solito in gruppi di decine o centinaia chiamati piatti forati 1-3 (Figura 1). Fenestrations consentono il trasferimento di plasma e nanosubstrates tra sangue e epatociti, creando un sistema di ultrafiltrazione altamente efficiente. Fenestrazioni sono strutture dinamiche – sia la loro dimensione e / o il numero può essere modificato in risposta a vari stati fisiologici, farmaci e malattie. Ad esempio, finestrature sono più grandi nel digiuno che a stomaco pieno 4; 2-di-iodoamphetamine aumenta numero finestratura, 5,6 e una riduzione delle dimensioni e del numero di finestrature per verifica delle cellule in invecchiamento e molte malattie stati 7-13 </sup>. La misurazione accurata delle dimensioni e del numero di finestrature è importante per capire come LSEC morfologia è influenzata da vari malattia, tossico, e gli stati fisiologici; il loro impatto sulla funzionalità epatica; e per sviluppare fenestrazione-modulante interventi terapeutici 1.
Lo studio delle finestrature è difficile. Il diametro di finestrature si trova sotto la risoluzione della microscopia ottica convenzionale, così precedenza solo osservazione usando microscopia elettronica sia in tessuto epatico o coltivate LSECs intatte stato possibile. Il microscopio elettronico a scansione (SEM) è stato più frequentemente usato per studiare dimensioni fenestrazione, frequenza e porosità (la percentuale di membrane LSEC che è perforata da fenestrations) perché SEM consente l'osservazione di grandi aree della superficie endoteliale e la misurazione di migliaia, se non decine di migliaia di finestrature. Nonostante la sua utilità, i risultati che sono riportati dagli studi SEM-based perParametri LSEC come le dimensioni fenestrazione, numero, frequenza e porosità variano ampiamente in letteratura (Tabella 1).
Fenestrazioni e piatti forati sono strutture fragili tale contratto, si rompono, si dilatano o fondono durante la preparazione dei campioni, quindi attenzione a trattamento è necessario per preservare la loro integrità. Elevata pressione di perfusione 14; errata osmolarità del fissativo e buffer 15; fissazione inadeguata o fissazione tempo; e la velocità di post-fissazione disidratazione ed essiccamento sono tutte le aree di elaborazione per SEM che possono produrre manufatti che interferiscono con la conservazione di ultrastruttura (Figura 2). Perdita di fenestrations ('defenestration') e finestratura restringimento può verificarsi come risultato di fissaggio poveri, con conseguente riduzione di diametro finestratura e porosità cellule. Metodi per migliorare la conservazione di campioni per analisi SEM sono stati descritti precedentemente 15-17 e verranno discussiqui con ulteriori suggerimenti su come migliorare la conservazione dei campioni. I principali obiettivi della conservazione del campione sono per rimuovere sangue dai sinusoidi modo che la superficie del LSEC può essere visualizzata e per evitare danni LSEC sia da alta pressione o fissazione ritardata. Tutta la perfusione del fegato di fissativo attraverso la vena porta è il metodo preferito per il fissaggio del fegato. Come descritto in dettaglio altrove 16,18 perfusione deve essere effettuata a bassa pressione (ad esempio 10 cm H 2 0) per evitare artefatti perfusione relativi alla pressione e danni al LSEC, tipicamente manifesta come grandi lacune all'interno della membrana cellulare. Tuttavia, la fissazione ragionevole spesso può essere ottenuto utilizzando ago perfusione di biopsie epatiche da esseri umani e animali, come descritto in dettaglio altrove 19. Questa tecnica comporta l'iniezione direttamente fissativo nel tessuto fino sangue viene lavata dal campione e il tessuto è ferma e fissa. Fissazione dei campioni per la microscopia elettronica deve essere perfORMED più rapidamente possibile dopo la cessazione del flusso di sangue per prevenire cambiamenti ultrastrutturali si verificano a seguito dei processi fegati autolitici estremamente rapidi.
Presentiamo anche un metodo di analisi di immagine che minimizza l'inclusione di manufatti, e standardizza la misurazione di finestrature. Variazione nella selezione di sinusoidi per micrografie, analisi di immagine di manufatti, e misurazione della superficie cellulare per porosità e fenestrazione frequenza hanno portato a grandi discrepanze nei risultati pubblicati. Un approccio standardizzato per la valutazione e la misurazione delle finestrature ei requisiti minimi per la presentazione dei dati non sono stati chiaramente affrontato nella letteratura in precedenza 4,10,20-31.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di precisione e riproducibilità misurare lo stato del fegato endotelio sinusoidale è un passo importante nella comprensione della biologia di queste cellule altamente specializzate. Le tecniche più recenti, come la microscopia strutturato illuminazione 32, microscopia a forza atomica 33 e d-STORM (diretta Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy) 34 saranno di comunicare informazioni importanti per quanto riguarda la morfologia di queste cellule in vitro, ma S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
| EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
| Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
| Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
| Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
| Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
| Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
| Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
| Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
| Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
| Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
| Ketamine | Must be optained under licence | ||
| Xylazine | Must be obtained under licence | ||
| Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |
References
- Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., Arias, I. M. . The Liver: Biology and Pathobiology. , 387-404 (2009).
- Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
- Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
- Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
- Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
- Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
- Le Couteur, D. G., Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. . Calorie Restriction, Aging and Longevity. , 191-216 (2010).
- McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
- Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
- Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
- Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
- Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
- Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
- Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
- Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
- Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
- Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
- Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
- May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).
- Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
- Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
- Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
- Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
- Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
- Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
- Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
- Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
- Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
- Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
- Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).
