En standardisert metode for analyse av Liver Sinus endotelceller og deres Fenestrations ved scanning elektronmikroskopi

Summary

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Abstract

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

Introduction

Leveren sinusformede endotelceller (LSECs) er høyt differensierte endoteliale cellene som kler veggen av hepatisk sinusoid. LSECs er perforert med fenestrations som er ikke-diaphragmed, porer transcellulær 50-250 nm i diameter. Opp til 20% av overflaten på LSECs er dekket av fenestrations, som vanligvis er i grupper på titalls til flere hundre kalles sikteplatene ^1-3 (figur 1). Fenestrations tillate overføring av plasma og nanosubstrates mellom blod og hepatocytter, og skaper en svært effektiv ultrafiltreringssystem. Fenestrations er dynamiske strukturer – både sin størrelse og / eller antall kan endres som følge av ulike fysiologiske tilstander, narkotika og sykdom. For eksempel fenestrations er større i fastende enn i matinntak ^4; 2-di-iodoamphetamine øker fenestration nummer, ^5,6 og en reduksjon i størrelse og antall fenestrations per oppstår celle i aldring og mange sykdomstilstander ^7-13 </sup>. Nøyaktig måling av størrelsen og antall fenestrations er viktig for å forstå hvordan LSEC morfologi påvirkes av ulike sykdommer, giftige, og fysiologiske tilstander; deres innvirkning på leveren funksjon; og for å utvikle fenestration modulerende terapeutiske intervensjoner ^1.

Studiet av fenestrations er vanskelig. Diameteren på fenestrations ligger under oppløsningen av konvensjonell lysmikroskopi, slik som tidligere bare observasjon ved hjelp av elektronmikroskopi i både intakte levervev eller kultur LSECs har vært mulig. Den scanning elektronmikroskop (SEM) har oftest vært brukt til å studere fenestrasjon størrelse, hyppighet og porøsitet (prosentandelen av LSEC membran som er perforert ved fenestrations) fordi SEM muliggjør observasjon av store områder av endoteloverflaten, og måling av tusener, hvis ikke titusenvis av fenestrations. Til tross for sin nytteverdi, resultatene som rapporteres fra SEM-baserte studier forLSEC parametere som fenestrasjon størrelse, antall og hyppighet porøsitet varierer mye i litteraturen (tabell 1).

Fenestrations og sil platene er skjøre strukturer som kontrakten brytes, dilate eller flyter sammen under prøven forberedelse, er derfor forsiktig behandling er nødvendig for å bevare sin integritet. Forhøyet perfusjonstrykket ^14; feil osmolaritet av fiksativ og buffere ^15; utilstrekkelig fiksering eller fiksering tid; og hastigheten av post-fiksering dehydrering og tørking, er alle områder av behandling for SEM som kan produsere gjenstander som interfererer med bevaring av ultrastruktur (figur 2). Tap av fenestrations ('defenestration') og fenestrasjon krymping kan oppstå som et resultat av dårlig fiksering, noe som resulterer i redusert fenestrasjon diameter og porøsitet. Metoder for å forbedre bevaring av prøver for SEM-analyse er blitt beskrevet tidligere ^15-17 og vil bli diskuterther med flere tips om hvordan du kan forbedre prøven bevaring. Hovedmålene prøven bevaring er å fjerne blodet fra sinuskurver, slik at overflaten av LSEC kan visualiseres og for å unngå skade fra LSEC enten for høyt trykk eller forsinket fiksering. Hele lever perfusjon av fiksativ via portvenen er den foretrukne metoden for leveren fiksering. Som beskrevet i detalj et annet sted ^16,18 perfusjon må foretas ved lavt trykk (for eksempel 10 cm H ₂ 0) for å unngå trykkrelaterte perfusjon gjenstander og skade på LSEC, typisk manifestert som store hull inne i cellemembranen. Imidlertid kan rimelig fiksering ofte oppnås ved anvendelse av nål perfusjon av leverbiopsi fra mennesker og dyr, som beskrevet i detalj et annet sted ^19. Denne teknikk innebærer direkte injisering av fikseringsmiddel i vevet til blodet som tømmes ut av prøven, og vevet er fast og løst. Fiksering av prøver for elektronmikroskopi må være performed så raskt som mulig etter avslutning av blodstrømmen for å forhindre ultra endringer som skjer som et resultat av leveren ekstremt hurtige autolytiske prosesser.

Vi presenterer også en fremgangsmåte for bildeanalyse som minimerer inkludering av gjenstander, og standardiserer måling av fenestrations. Variasjon i valget av sinuskurver for mikrobilder, bildeanalyse av gjenstander, og måling av celleområdet for porøsitet og fenestrasjon frekvens har ført til store avvik i publiserte resultater. En standardisert metode for evaluering og måling av fenestrations og minimumskravene for datapresentasjon har ikke vært tydelig adressert i litteraturen tidligere ^4,10,20-31.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer som involverer bruk av dyr blir utført i henhold til lokal lovgivning. Vårt arbeid er godkjent av Sydney Local Health District Animal Welfare Committee. De tillatte prosedyrene er beskrevet i dokumentasjonen prosjektet lisens og følge retningslinjer som sikrer velferden til dyret til enhver tid. Sikre etterlevelse av regelverket om dyreforsøk i landet der arbeidet utføres. 1. Protokoll for Forbereder EM fiksativ Til 100 ml av fikseringsmiddel, fremstille…

Representative Results

Initial visualisering ved lav forstørrelse ved scanning-elektronmikroskopi avslører en flat overflate av leveren prøven med et eksponert område som er stort nok til å observere mange store leveren fartøyer og sinusformer (figur 1A). Sikre korrekt leveren blokk plassering på monterings stubben er vesentlig for å oppnå klare bilder av de sinus og Glisson s kapsel av leveren bør unngås på grunn av dette (figur 1B). Økning av forstørrelsen tillater nærmere inspeksjon av det t…

Discussion

Evnen til nøyaktig og reproduserbart måle status av leveren sinusformet endotelet er et viktig skritt i å forstå biologien til disse svært spesialiserte celler. Nyere teknikker som strukturert belysning mikros ^32, atomic force mikros ³³ og d-STORM (direkte Stochastic Optical Reconstrucion Mikros) ³⁴ vil gi viktig informasjon om morfologi av disse cellene in vitro, men SEM er fortsatt den primære metode for å visualisere og måle deres struktur i situ.

<p clas…

Materials

Name of material	Company	Catalogue Number	Comments
EM grade Glutaraldehyde	ProSciTech	C001	Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder	Sigma Aldrich	158127	Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder	Sigma Aldrich	C0250	Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016	Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide	ProSciTech	C011	Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute	Sigma Aldrich	459836	100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol	Labtech	EL5	Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	52619	Allow to reach room temperature before use
Cannulas	Terumo	TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C	18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape	ProSciTech	IA0201
Carbon Paint	ProSciTech	I003
Ketamine			Must be optained under licence
Xylazine			Must be obtained under licence
Molecular Sieve	Sigma Aldrich	208647	Removes water from the 100 % Ethanol