Bone Medium acondicionado: Preparación y Bioensayo
Summary
Se describe aquí cómo preparar medio hueso acondicionado (BCM) y probar su actividad in vitro.
Abstract
Injertos óseos autólogos son ampliamente utilizados en la cirugía oral y maxilofacial, ortopedia y traumatología. Injertos óseos autólogos no sólo reemplazan el hueso faltante, también apoyan el complejo proceso de regeneración ósea. Este comportamiento favorable de los autoinjertos se atribuye a las tres características: osteoconductividad, osteogenicidad y osteoinductividad. Sin embargo, hay otro aspecto: Bone injertos de liberar una gran variedad de moléculas, incluyendo factores de crecimiento, que pueden dirigirse a las células mesenquimales implicadas en la regeneración ósea. Las propiedades paracrinos de injertos óseos se pueden estudiar in vitro mediante el uso de medio hueso acondicionado (BCM). Aquí presentamos un protocolo sobre cómo prepararse medio hueso acondicionado de hueso cortical cerdo nativo, y el hueso que sufrió el procesamiento térmico o desmineralización. Las células pueden ser expuestos directamente a BCM o sembradas en biomateriales, tales como membranas de colágeno, previamente remojados con BCM. Damos ejemplos para in vitro bioassays con células mesenquimales en la expresión de genes regulados TGF-β. Los protocolos presentados deben animar a revelar aún más los efectos paracrinos de injertos óseos durante la regeneración ósea y abrir un camino para la investigación traslacional en el amplio campo de la cirugía reconstructiva.
Introduction
El hueso autólogo es ampliamente utilizado para cerrar defectos que se produjeron como consecuencia de la malformación, la cirugía de resección, la cirugía reconstructiva trauma, y antes de la colocación del implante 1,2. La comprensión de los principios biológicos de cómo injertos óseos apoyan el proceso de consolidación del injerto no sólo es clave para entender por qué los autoinjertos son considerados como el estándar de oro en la cirugía reconstructiva, también es biónico para la mejora del diseño de los sustitutos óseos 3. Sin embargo, la consolidación del injerto es más rápido con hueso autólogo en comparación con sustitutos óseos 4,5. Por lo tanto, es imperativo para revelar los mecanismos moleculares y celulares que hacen hueso autólogo tan eficaz para apoyar la regeneración ósea.
Hay tres características de libros de texto de autoinjertos que se consideran para apoyar el proceso de consolidación 6,7. En primer hueso, autólogo es osteoconductiva, proporcionar orientación para el hueso de nueva formación para creceren el defecto. En segundo lugar, el hueso autólogo es osteogénico, lo que significa que contiene células mesenquimales que pueden diferenciarse en osteoblastos 8. Hueso Tercero, autólogo es osteoinductivo como factores de crecimiento, como las proteínas morfogenéticas óseas sepultados en la matriz pueden iniciar el proceso de endocondral o incluso la formación de hueso intramembranosa 9. Hay otro aspecto: astillas de hueso recién preparados tienen una función paracrina sobre la base de las observaciones in vitro con "medio hueso acondicionado" 10-15. También el impacto de mielopoyesis debe mencionarse 16. Un término similar "medio de matriz ósea desmineralizada acondicionado" ya fue acuñado en 1996 y es compatible con el concepto general de una función paracrina del hueso, incluso cuando procesada por desmineralización 17. Para nuestros propósitos, BCM puede prepararse a partir de cerdo fresca mandíbulas 10,11. Análisis proteómico de BCM revelaron la composición compleja, incluyendo hecho de crecimientoors y componentes de la matriz extracelular 10, que también se extiende el conocimiento existente sobre el proteasoma de toda ósea 18,19. Por lo tanto, BCM debe reflejar la actividad de lanzamiento de varias modificaciones de injertos óseos in vitro.
¿Qué ocurre cuando las células mesenquimales, por ejemplo los aislados de virutas de hueso o de tejido blando oral, están expuestos a BCM? In vitro, BCM reduce osteogénico y la diferenciación adipogénica, y provoca un fuerte aumento de la expresión de IL11 11. Genoma amplia microarrays reveló más genes que se expresó diferencialmente en las células mesenquimales en respuesta a BCM. Entre estos genes son adrenomedulina (ADM), IL11, IL33, NADPH oxidasa 4 (NOX4), proteoglicanos 4 (PRG4 o lubricina) y pentraxina 3 (PTX3) 15. BCM obtenido a partir de astillas de hueso en autoclave no pudo cambiar la expresión de los genes respectivos 14. BCM de astillas de hueso que se sometieron a la pasteurización y la congelación fue capaz decambiar la expresión del gen 14. Medio de la matriz ósea desmineralizada (DBM-CM) También acondicionado cambia la expresión de TGF-β genes regulados 20. Curiosamente, las membranas de barrera de colágeno utilizados para proteger los chips de hueso a partir del tejido blando circundante 21,22, adsorbidos aquellas partes de BCM que son responsables de los cambios en la expresión génica 23. Investigación BCM se puede extender a otros tipos de células que participan en la regeneración ósea, tales como los osteoclastos de resorción ósea y células endoteliales, para nombrar unos pocos. En general, los datos se acumulan in vitro proporcionan la base científica para el diseño de un estudio preclínico.
El presente protocolo es doble: Primero, muestra cómo preparar BCM. En segundo lugar, muestra cómo probar su actividad biológica basado en células mesenquimales in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bone medio acondicionado refleja la actividad liberada de injertos óseos durante las primeras etapas de la regeneración ósea. El protocolo se describe aquí puede adaptarse para estudiar la respuesta de diferentes tipos de células implicadas en la regeneración ósea. Además, el protocolo se puede utilizar para preparar el medio de rellenos óseos o hueso procesado condicionado. Los métodos son fáciles de realizar y se basan en un concepto simple: los factores liberados de varios hueso nativo y procesados. La com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Catherine Solioz for her skillful assistance.
Materials
| Pig Mandibles | Local bucher | ||
| Bone Scraper | Hu-Friedy | PPBUSE2/36 | |
| Antibiotics & Antimicotics | All life Technologies | 15240-062 | |
| Collagen Membranes (Bio-Gide) | Geistlich | ||
| Fetal Calf Serum | Invitrogen Corporation | 16030074 | |
| DMEM | Invitrogen Corporation | 21885-025 | |
High Pure RNA Isolation Kit |
Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Primers | Microsynth | ||
| SYBR Green (for Q-RT-PCR) | Roche | 4673484001 | |
| PBS | Roche | 11666789001 |
References
- Buser, D. Long-term Stability of Early Implant Placement with Contour Augmentation. Journal of dental research. , (2013).
- Chiapasco, M., Casentini, P., Bone Zaniboni, M. augmentation procedures in implant dentistry. The International journal of oral & maxillofacial implants. 24 Suppl. , 237-259 (2009).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Bone Tsiridis, E. substitutes: an update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27. , (2005).
- Jensen, S. S., Broggini, N., Hjorting-Hansen, E., Schenk, R., Bone Buser, D. healing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and beta-tricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 17, 237-243 (2006).
- Jensen, S. S. Evaluation of a novel biphasic calcium phosphate in standardized bone defects: a histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clinical oral implants research. 18, 752-760 (2007).
- Grabowski, G., Bone Cornett, C. A. graft and bone graft substitutes in spine surgery: current concepts and controversies. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 21, 51-60 (2013).
- Khan, S. N. The biology of bone grafting. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 13, 77-86 (2005).
- Bohr, H., Ravn, H. O., Werner, H. The osteogenic effect of bone transplants in rabbits. The Journal of bone and joint surgery. British. 50, 866-873 (1968).
- Bone Urist, M. R. formation by autoinduction. Science. 150, 893-899 (1965).
- Caballé-Serrano, J. D., Buser, D., Gruber, R. Proteomic analysis of porcine bone conditioned medium. The International journal of oral & maxillofacial implants. , (2014).
- Peng, J. Bone-Conditioned Medium Inhibits Osteogenic and Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Cells In Vitro. Clinical implant dentistry and related research. , (2014).
- Brolese, E., Buser, D., Kuchler, U., Schaller, B., Gruber, R. Human bone chips release of sclerostin and FGF-23 into the culture medium: an in vitro pilot study. Clinical oral implants research. , (2014).
- Caballé-Serrano, J., Bosshardt, D. D., Gargallo-Albiol, J., Buser, D., Bone Gruber, R. conditioned medium enhances osteoclastogenesis in murine bone marrow cultures. Clin Oral Impl Res; in. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Zimmermann, M. Bone-conditioned medium changes gene expression in bone-derived fibroblasts). IJOMI accepted. , (2014).
- Fulzele, K. Myelopoiesis is regulated by osteocytes through Gsalpha-dependent signaling. Blood. 121, 930-939 (2013).
- Becerra, J., Andrades, J. A., Ertl, D. C., Sorgente, N., Nimni, M. E. Demineralized bone matrix mediates differentiation of bone marrow stromal cells in vitro: effect of age of cell donor. Journal of. 11, 1703-1714 (1996).
- Kupcova Skalnikova, ., H, Proteomic techniques for characterisation of mesenchymal stem cell secretome. Biochimie. , (2013).
- Romanello, M. Osteoblastic cell secretome: A novel role for progranulin during risedronate treatment. , (2013).
- Schuldt Filho, ., G, Conditioned medium of demineralized bone matrix activates TGF-β signaling pathways in mesenchymal cells in vitro. J Cranio Maxill Surg. , (2015).
- Buser, D., Chen, S. T., Weber, H. P., Belser, U. C. Early implant placement following single-tooth extraction in the esthetic zone: biologic rationale and surgical procedures). The International journal of periodontics & restorative dentistry. 28, 441-451 (2008).
- Stoecklin-Wasmer, C. Absorbable collagen membranes for periodontal regeneration: a systematic review. Journal of dental research. 92, 773-781 (2013).
