Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
La síntesis de proteínas es un proceso fundamental para la expresión de genes que afectan diversos procesos biológicos en particular de adaptación a las condiciones ambientales. La etapa de iniciación, que consiste en el montaje de las subunidades ribosomales en el ARNm codón de iniciación, inicio factor involucrado incluyendo EIF4G1. Los defectos en este paso limitante de la velocidad de la traducción están vinculadas a diversos trastornos. Para el estudio de las posibles consecuencias de estas desregulaciones, Xenopus laevis constituyen un modelo atractivo con un alto grado de conservación de los mecanismos celulares y moleculares esenciales con humanos. Además, durante la maduración meiótica, los ovocitos son transcripcionalmente reprimidos y todas las proteínas necesarias son traducidos de mRNAs preexistentes, derivados de la madre. Este modelo de bajo costo permite ARNm exógeno para convertirse perfectamente integrada con una traducción efectiva. Aquí se describe un protocolo para la evaluación de traducción con un factor de interés (en este caso EIF4G1) usando stored mRNA materna que son los primeros en ser polyadenylated y traducidos durante la maduración de ovocitos como una lectura fisiológico. Al principio, el ARNm sintetizado mediante transcripción in vitro de plásmidos de interés (aquí EIF4G1) se inyectan en oocitos y la cinética de la maduración de ovocitos por detección de averías Germinal de vesículas se determina. El objetivo mRNA materna estudiada es la serina / treonina mos-proteína-quinasa. Su poliadenilación y su posterior traducción son investigadas junto con la expresión y fosforilación de las proteínas de los MOS cascada de señalización implicada en la maduración de ovocitos. Las variaciones del protocolo actual que presente también se proponen defectos de traslación para enfatizar su aplicabilidad general. A la luz de la evidencia de que la síntesis de proteínas aberrantes pueden estar involucrados en la patogénesis de los trastornos neurológicos emergente, este modelo ofrece la oportunidad de evaluar fácilmente este deterioro e identificar nuevos objetivos.
Introduction
Las proteínas son elementos esenciales de la vida celular y por lo tanto a mayor escala del organismo. Aseguran la mayoría de las funciones celulares, incluyendo la estructura, el transporte, la catálisis de reacción, la regulación, la expresión génica etc. Su expresión es el resultado de un complejo mecanismo de traducción permitiendo la conversión de un ARNm en proteína. La traducción se somete a diversos controles para adaptarse y para regular la expresión génica de acuerdo con las necesidades de células, durante el desarrollo y la diferenciación, el envejecimiento, estrés fisiológico o manifestaciones patológicas.
La traducción se divide en 3 fases (iniciación, elongación y terminación) y presenta 3 sistemas de traducción de iniciación con el fin de responder a estas necesidades: cap-dependiente, la tapa independiente a través del segmento de entrada al ribosoma interno (IRES) estructuras y capitalización Independiente potenciadores de traducciones ( CITE).
La mayoría de los ARNm eucarióticos se traducen en una gorra-dependent manera a través de la 7-metilguanosina tapa 5'-trifosfato que sirve como una función de reconocimiento durante la síntesis de proteínas. Esta tapa se une a eIF4E, un componente del complejo eIF4F con EIF4G1 y eIF4A. Asociado con otros socios como poli (A) proteína de unión (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met, estos factores de iniciación de traducción permite circularize ARNm y mejorar su accesibilidad a las formas 43S complejo hasta que el codón de iniciación AUG reconocimiento 1. Este evento se corresponde con el final de la iniciación de la traducción es decir, el primer paso de la traducción.
Traducción-Cap independiente es utilizado por ARNm que codifica para proteínas esenciales bajo condiciones de estrés que inducen a la proliferación celular y la apoptosis instancia. Este mecanismo implica estructuras secundarias en el ARNm 5 'región no traducida (UTR) llama IRES, el extremo carboxi-terminal de EIF4G1 asociado con eIF4A y el complejo 43S. La unión de este 43S previo a la iniciación complex a IRES inicia la tapa traducción independiente sin la necesidad de factor de eIF4E 2,3.
Finalmente, otro mecanismo de traducción todavía no se entiende bien apoya esta actividad traductora-cap independiente bajo condiciones de estrés a través de CITE estructuras ubicadas dentro de ARNm UTR 4.
A través de estas diversas modalidades de traducción que difieren en sus etapas de iniciación, la traducción juega un papel crítico en la homeostasis celular y cualquier cambio en uno de estos procesos sería por lo tanto un impacto en el organismo con pequeña a los efectos de gran escala. De hecho, el inicio es un paso limitante de la velocidad que rige los procesos de traducción correctas de ARNm en proteínas y por lo tanto el objetivo de numerosos controles y puntos de regulación 5. Ya sea para éste o para los componentes de estos procesos, si uno resulta ser defectuosa, se perturba el equilibrio establecido en la célula y por lo tanto podría llevar a condi patológicaciones. En este contexto, las mutaciones en factores de traducción han participado en varios trastornos que incluyen trastornos neurodegenerativos tales como `leucoencefalopatía con desaparición matter' blanco (eIF2B1-5 subunidad) 6, en el síndrome de Walcott-Rallison (gen que codifica para EIF2AK3 PERK) 7, potencialmente, en enfermedad (EIF4G1 p.R1205H) de Parkinson 8. Por tanto, es importante llevar a cabo estudios celulares y moleculares de estas proteínas mutantes para aumentar nuestro conocimiento sobre el desarrollo de la enfermedad y en el proceso general de la iniciación de la traducción.
Para llevar a cabo estos estudios, es esencial para elegir los modelos más adecuados para observar las consecuencias de estas mutaciones Xenopus laevis están particularmente bien adaptados debido a sus propiedades fisiológicas y bioquímicas:. Sincronía fisiológica (bloqueado en la fase G2 del ciclo celular) , alta capacidad de síntesis de proteínas (200-400 ng / día / ovocitos), alto número de OOC extraídaytes de un mismo animal (800-1.000 ovocitos / hembra) y tamaño de la celda (01/02 a 01/04 mm de diámetro) que facilita su manipulación. La microinyección de oocitos de Xenopus con mRNA sintetizado se puede realizar fácilmente para diseccionar pasos de traducción. En esta vista se presenta otras ventajas. Dada la velocidad de progresión de la meiosis y de la traducción después de la microinyección de ARNm (~ 24 h), Xenopus ovocito representa un sistema rápido en comparación con los sistemas celulares reconstituidas (extraído de E. coli, los gérmenes de trigo o reticulocitos de conejo …) en el que un mRNA es traducido con una velocidad de traducción reducida y a una velocidad inferior. Por lo tanto, los efectos de una mutación introducida en un mRNA serán rápidamente observable y estudiado fácilmente en varios ovocitos. Otra de las ventajas de los ovocitos de Xenopus es que los ARNm maternas están latentes y traducción de la proteína se bloquea antes de la estimulación de progesterona. La adición de la progesterona es, pues, un buen medio para controlar la inducción de traducción. P citoplasmáticaolyadenylation no se produce durante la ovogénesis. Se inicia durante la maduración de ovocitos en los ovocitos de progesterona estimulada en un orden temporal y continúa durante el desarrollo temprano y podría ser utilizado para estudiar los diferentes pasos de la traducción.
La poliadenilación del ARNm meses es de los primeros en aparecer y pertenece a Aurora A / Eg2, histona-Como B4 ARNm a la clase de genes "de maduración temprana" como se define en Charlesworth et al. (2004) 9. La inducción de la traducción de ARNm "tardías", como la ciclina A1 y ciclina B1 se produce alrededor de la época de la ruptura de la vesícula germinal (GVBD). Mos ARNm codifica una serina / treonina proteína quinasa-. Su traducción es crucial ya que induce la cascada de MAP quinasa que activa indirectamente la maduración de los ovocitos. En efecto, en respuesta a la progesterona, la poliadenilación del mRNA MOS se mejora a través de un proceso que implica Aurora A / Eg2 proteínas reguladoras y otras proteínas de unión de ARN con THe 3'UTR del mRNA mos. Este aumento de la poliadenilación del mRNA MOS conduce a un aumento del nivel de proteína MOS, que a su vez activa MEK1. Este proceso media la activación de la quinasa extracelular de señalización reguladas 2 (ERK2) (Figura 1). Esta cascada de señalización puede entonces activar el M-fase de maduración promoción de factores, un complejo formado por Ciclina B y Cdc2 quinasa, y, finalmente, resulta en la reanudación meiótica.
Por lo tanto en oocitos de Xenopus laevis, el estudio de mRNA maternos tales como MOS fácilmente podría ser utilizado para poner a prueba su traducibilidad con varios puntos finales de su poliadenilación eficiente a la traducción de varios meses de señalización componentes, incluyendo también la determinación de la tasa de GVBD. Este sistema es, por tanto, interesante evaluar las primeras consecuencias de las mutaciones en los factores de iniciación de la traducción, sin interferencia de recién transcrito ARNm o de la eficiencia de la transfección, los problemas a menudo ocurren con eukaryestudios de células óticas.
Aquí, se establece un protocolo donde mRNAs EIF4G1 mutantes se microinyectaron en oocitos de Xenopus laevis y la traducción del mRNA materna se prueba. En la presencia de un defecto en la progresión de la GVBD, mos mRNA de poliadenilación que es esencial para la progresión a través del ciclo celular meiótica del ovocito y para la posterior traducción de mRNAs de clase tempranos y tardíos está comprobada. La fosforilación Aurora A / Eg2 y ERK también se estudia para confirmar la consecuencia de MOS deregulation.Thus, oocitos de Xenopus representan una forma sencilla de analizar las diferentes etapas de la traducción del ARNm.
Protocol
Representative Results
Discussion
La traducción es un mecanismo implicado en la fisiopatología de numerosos trastornos humanos, incluyendo varias enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo en la enfermedad de Parkinson varios informes sugirieron que el deterioro en la traducción asociada con mutaciones hereditarias 8,12,13.
Varios modelos celulares están disponibles para estudiar la traducción. Aquí, con el fin de estudiar las consecuencias de traslación de una mutación en EIF4G1 que actúa como dominant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
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