בידוד וCryopreservation של שריר לב עכברוש ילודים
Summary
The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Abstract
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Introduction
תרבית תאים של שריר לב היא כלי קריטי במחקר הלב מודרני. cardiomyocytes עכברוש בילוד (NRCMs) נמצא בשימוש נפוץ מאז הבידוד והתרבות היא קלה יותר מזה של cardiomyocytes עכברוש המבוגר 1. שיטת NRCM עדיין יש מספר מגבלות, כולל הליך ארוך בידוד והתפשטות תאים מוגבל בצלחת. ישנם מספר רב של פרוטוקולים לבידודה של NRCMs עם רוב בדרך כלל דורש 4-48 שעות של עבודת 2-6. בנוסף, התאים לעתים קרובות מבודדים בין 1 ל גורי חולדה ישנה 2 ימים 2,4-7; העיתוי של הלידה יכול להיות בלתי צפוי וסכסוך עם עבודה אחרת במעבדה. הבידודים יכולים להיות לא יעילים ובזבזניים אם רק כמות קטנה של תאים דרושות לניסויים. רוב המאמצים בשיפור מיקוד העבודה על צמצום זמן הבידוד, אך זה לא פותר את הבעיות של תזמון הלידה של הגורים.
כחלופות, מעבדות רבות לנצלcardiomyocytes שמקורם בתאי גזע עובריים (ESCs) או תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs). עם זאת, תהליך תכנות מחדש ו / או בידול יכול להיות מאוד זמן רב ויקר גם כן. לא יכולה להיות בעיות אחרות בעת שימוש בתאים אלה כמודלים myocyte במבחנה. שני cardiomyocytes נגזר ESC- וiPSC- הוכח להפגין הבדלים באלקטרופיזיולוגיה מcardiomyocytes העיקרי 8-10.
NRCMs הניתק הם מסוגל להיות מאוחסן במשך כמה ימים באמצעות קירור 11, אך זה אינו מאפשר לאחסון ארוך טווח. חנקן נוזלי משמש בדרך כלל לשימור תאים לתקופה גדולה יותר של זמן, אבל דורש cryoprotectant כגון sulfoxide דימתיל (DMSO). מחקרים קודמים הראו כי הריכוז האידיאלי בין 5-10% DMSO בתקשורת ההקפאה מאפשר להקפאה של NRCMs, עדיין גם אז הכדאיות נשארה 12 נמוכים. למרות DMSO מסייע להגן על התאים במהלך חופשיזיע, זה יכול להיות רעיל לתאים בריכוזים מעל 1.5% 13. מחקרים קודמים הראו כי הסרת לאט DMSO מהתאים, עשוי לשפר את תא כדאיות 14.
אנחנו ביקשנו לשפר את היעילות של מבחני מבוססי תאי NRCM ידי cryopreserving התאים הבאים בידוד. זה מאפשר לתאים להיות מופשרים ושימוש בעת צורך, הפחתת התדירות של בידודים וצריכה של בעלי חיים. באמצעות שיטה זו, אנו מראים כי ניתן cryopreserve NRCMs ולהפשיר אותם לשימוש במועד מאוחר יותר. לאחר הפשרת התאים לשמור על כדאיות מקובלת ולייצר תרבויות NRCM כי הם חיוביים לactinin α-sarcomeric (α-SA) והחוזה באופן ספונטני.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מאפשר לNRCMs להיות מבודד, cryopreserved, ומופשר. הפשרת התאים היא חלק חיוני של ההליך. סדרה של דילולים DMSO משמשת להסרת לאט DMSO מהתאים 14. חשוב שהחילוץ של DMSO להתבצע מהר ככל התאים רגישים במיוחד למוות מייד לאחר הפשרה. אם יותר או פחות תאים נדרשים להפשרה, הכרכים של פתרונ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
Materials
| IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50mL Conical | Corning | 430828 | |
| 15mL Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -. D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
