We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.
Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.
אפנון כולינרגית של רגישות מעגל תורם להיבטים בסיסיים של הכרה, ואפנון כולינרגית שינה הוא תכונה של הפרעות ניווניות ונוירו-פסיכיאטריים, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סכיזופרניה והתמכרות 1-4. מנגנון שנקבע בהנחיית כולינרגית של שידור הסינפטי במערכת העצבים המרכזית הוא באמצעות הפעלה ישירה של nAChRs המקומי באתרים מראש הסינפטי. הפעלה של קולטנים מראש הסינפטי אלה מובילה לעליית 2 + (i [Ca 2 +]) במסופים מראש הסינפטי Ca תאיים – הן במישרין, בשל מוליכות סידן גבוהות יחסית של תת מסוימים nAChR, ובעקיפין, באמצעות מפלי איתות תאיות 5, ובכך משפרים את שחרור הנוירוטרנסמיטר. למעשה, ההפעלה של nAChRs מראש הסינפטי נקשרה עם שינויים בשחרור של מגוון רחב של נוירוטרנסמיטורים כוללים גלוטמט, GABA, ACH,דופמין ND 6-10. למרות שתהליך זה נחקר באופן עקיף באמצעות שיטות אלקטרו בהסינפסות שונות, כתבים אופטיים של [Ca 2 +] i ומחזור שלפוחית סינפטית לאפשר מדידה ישירה ובזמן מדויק יותר של תופעות קדם-סינפטי.
לוקליזציה טרום הסינפטי של nAChRs הודגמה באופן משכנע עם תיוג חיסוני זהב ישיר של nAChRs במיקרוסקופי אלקטרונים (EM) רמת 11,12. כמה טכניקות אחרות יש גם שימשו לטיפול בלוקליזציה nAChR בעקיפין, לרבות מיקומים של מפלצות חלבון פלואורסצנטי subunit- nAChRs גילוי בנוירונים בתרבית 13,14, הקלטת אלקטרו של זרמי nAChR במסופים הסינפטי 15,16, מעקב אחר שינויי ניקוטין מושרה ב[ Ca 2 +] i במסוף עצב הסינפטי על ידי הדמיה לחיות תא 17, וניטור עקיף של שחרור הנוירוטרנסמיטר במסוף הסינפטי על ידיטכניקות הדמיה תא חיות עם אינדיקטורים ניאון, כולל exocytosis של שלפוחית סינפטית שנצפה על ידי צבעי styryl amphipathic FM (FM1-43 וFM4-64) ו / או synapto-pHluorin ועל ידי כתבים ספציפיים ניאון עצבי, כגון CNiFERs לאח וiGluSnFr לגלוטמט 18-20. בסך הכל, גישות הנוכחיות אלה לזיהוי לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs הן מסובכות, ודורשות מערכות וטכניקות מיוחדות כדי לאפשר זיהוי אמין וניטור פיסיולוגי של פעילות טרום-סינפטי.
כאן אנו מתארים פרוטוקולים וציוד למערכת שיתוף תרבות במבחנה של היפוקמפוס הגחון (vHipp) – גרעין נסמך (nAcc) מעגל המספק גישה ישירה לזהות ולנתח את שני מרכיבים של לפני ואחרי-סינפטי של העברת הסינפטית. אנחנו מראים דוגמאות של לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs והדמית התא החי של nAChR תיווך Ca 2 + ALO איתות ושחרור הנוירוטרנסמיטרהאקסונים ng vHipp. המשך טבעי (וברור) של הפרוטוקול המובא כאן הוא ההכנה של אנשי קשר לפני ואחרי-סינפטי המורכב מתאי עצב מגנוטיפים שונים. באופן זה את התרומה של מוצר גן מסוים למראש ו / או פוסט-סינפטי מנגנונים של אפנון ניתן להעריך באופן ישיר.
הכנת שיתוף התרבות מתוארת מחדש נכנע מעגלים בהיפוקמפוס-נסמכים הגחון במבחנה. בחינת היתרי הכנה פשוטה יחסית ואמינה זה של פרופילי מרחב ובזמן שבו הפעלה של nAChRs מראש הסינפטי לעורר משופרת שידור glutamatergic 5, 21.
שיתוף תרבויות מוגדרו?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-α4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.
1, Culture Media (50 ml) | |||
Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
2, washing media (HBSS, 100 ml) | |||
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
3, HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
5, Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |