To-foton Imaging af intracellulære Ca<sup> 2+</sup> Håndtering og nitrogenoxid Produktion i Endothelial og glatte muskelceller af en isoleret rotteaorta
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
Calcium er en meget vigtig regulator af mange fysiologiske processer i vaskulære væv. De fleste endotelceller og glatte muskelceller fungerer meget afhængige af ændringer i intracellulært calcium ([Ca2 +] i) og nitrogenoxid (NO). For at forstå, hvordan [Ca2 +] i, NO og nedstrøms molekyler håndteres af et blodkar som respons på vasokonstriktorer og vasodilatorer, vi udviklet en ny teknik, der anvender calcium-mærkning (eller NO-mærkning) farvestoffer med to foton mikroskopi at måle calcium håndtering (eller NO produktion) i fartøjer isolerede blod. Beskrevet her er en detaljeret trin-for-trin procedure, der viser, hvordan man isolerer en aorta fra en rotte, label calcium eller NO inden for endotelceller eller glatte muskelceller, og image calcium transienter (eller NO-produktion) ved anvendelse af en to foton mikroskop efter fysiologisk eller farmakologiske stimuli. Fordelene ved anvendelse af fremgangsmåden er multi-fold: 1) er det muligt at simultanly måle calcium transienter i både endotelceller og glatte muskelceller som reaktion på forskellige stimuli; 2) den tillader en at billedet endotelceller og glatte muskelceller i deres native indstilling; 3) denne metode er meget følsom over for intracellulær calcium eller ingen ændringer og genererer billeder i høj opløsning til præcise målinger; og 4) beskrevne fremgangsmåde kan anvendes til måling af andre molekyler, såsom reaktive oxygenarter. Sammenfattende at anvendelse af to foton laser emission mikroskopi overvåge calcium transienter og NO produktionen i endotel og glatte muskelceller i en isoleret blodkar har givet kvantitative data af høj kvalitet og fremmet vores forståelse af de mekanismer, der regulerer vaskulær funktion.
Introduction
Calcium er en grundlæggende anden budbringer inden vaskulære celler, såsom endotel og glatte muskelceller. Det er den primære stimulus for vaskulær sammentrækning og spiller en stor rolle i vaskulær dilatation, herunder dens virkninger gennem NO generation inden for endotel. På grund af begrænsninger i imaging teknologier har det været næsten umuligt at observere calcium håndtering inden den intakte beholder. Udviklingen af to foton billeddannelse og oprettelse af nye calcium eller ingen mærkning farvestoffer, gør det muligt at billedet i en tilstrækkelig dybde og opløsning til at begynde at forstå calcium dynamik og NO produktionen i karrene.
To foton mikroskopi er for nylig blevet anvendt i væv, organer og endog hele dyreforsøg på grund af dets overlegne evne til at trænge dybt væv med lav baggrundsfluorescens og højt signal følsomhed. 1,2 Den smalle spektrum af to foton excitation ved illumination omdrejningspunkt og brugen af ikke-descanned detektorer er grundene to foton mikroskopi er overlegen i forhold til traditionelle konfokal mikroskopi. Konfokal mikroskopi kan ikke producere billeder af høj kvalitet på det nødvendige væv dybde på grund af auto-fluorescens og spredningen af out-of-fokus lys ind i konfokal pinhole. Vi har derfor udviklet en metode under anvendelse af en to foton mikroskop for at måle [Ca2 +] i signalering og NO-produktion i intakte, individuelle blodkarceller med høj opløsning og et lavt signal-til-støj-forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksperimentel Oversigt. For bedre at forstå det bidrag af calcium og NO til vaskulær fysiologi blev en hidtil ukendt fremgangsmåde udviklet til at måle [Ca2 +] i og NO inden glat muskulatur og endotelceller af isolerede intakte aorta. Sammen denne protokol består af disse kritiske trin: 1) Mekanisk isolation og forberedelse (ikke enzymatisk fordøjelse) af fartøjet. Det er vigtigt at holde vævet sund og intakt så meget som muligt for at opnå optimale fysiologiske optagelser. 2) In…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. William Cashdollar og Northwestern Mutual Foundation Imaging Center ved Blood Research Institute of Wisconsin for at få hjælp med billeddiagnostiske undersøgelser. Vi takker også Dr. Daria Ilatovskaya for kritisk læsning af dette manuskript og hjælpsomme diskussion. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health Tilskud HL108880 (til AS) og DP2-OD008396 (til AMG).
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM – a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
