A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca<sup> 2+</sup> Manipolazione e l'ossido nitrico Produzione in endoteliale e della muscolatura liscia cellule di un isolato Rat Aorta
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
Il calcio è un regolatore molto importante di molti processi fisiologici nei tessuti vascolari. La maggior parte delle funzioni endoteliali e muscolari lisce altamente dipendono dalle variazioni dei calcio intracellulare ([Ca 2+] i) e l'ossido nitrico (NO). Al fine di comprendere come [Ca 2 +] i, NO e molecole a valle sono gestite da un vaso sanguigno in risposta a vasocostrittori e vasodilatatori, abbiamo sviluppato una nuova tecnica che si applica calcio etichettatura (o NO-etichettatura) coloranti con due fotoni microscopia per misurare la movimentazione di calcio (o la produzione di NO) nei vasi sanguigni isolati. Descritto qui è una procedura dettagliata passo-passo che illustra come isolare un dell'aorta da un topo, etichetta di calcio o di NO nelle cellule endoteliali o muscolari lisce, e l'immagine del calcio transienti (o la produzione di NO) utilizzando un microscopio a due fotoni seguente fisiologico o stimoli farmacologici. I vantaggi di utilizzare il metodo sono multi-fold: 1) è possibile simultanealy misurare transienti di calcio in entrambe le cellule endoteliali e cellule muscolari lisce in risposta a stimoli diversi; 2) che permette di cellule un'immagine endoteliali e cellule muscolari lisce nel loro ambiente nativo; 3) questo metodo è molto sensibile al calcio intracellulare o nessuna modifica e genera immagini ad alta risoluzione per misurazioni precise; e 4) approccio descritto può essere applicato alla misura di altre molecole, quali le specie reattive dell'ossigeno. In sintesi, l'applicazione della microscopia a due fotoni emissione laser per monitorare transienti di calcio e la produzione di NO nelle endoteliali e muscolari lisce cellule di un vaso sanguigno isolato ha fornito dati quantitativi di alta qualità e promuovere la nostra comprensione dei meccanismi che regolano la funzione vascolare.
Introduction
Il calcio è un secondo messaggero fondamentale all'interno delle cellule vascolari quali cellule endoteliali e muscolari lisce. È lo stimolo primario per la contrazione vascolare e svolge un ruolo importante nella dilatazione vascolare, compresi i suoi effetti attraverso NO generazione nel endotelio. A causa di limitazioni di tecnologie di imaging, è stato virtualmente impossibile osservare movimentazione calcio all'interno del vaso intatto. Lo sviluppo dei due sistemi di imaging fotonica e la creazione di nuova di calcio o di coloranti di etichettatura, permette di immagine ad una profondità e una risoluzione sufficiente per iniziare a comprendere le dinamiche del calcio e la produzione di NO all'interno del sistema vascolare.
Microscopia a due fotoni è stata recentemente applicata in tessuti, organi e studi, compresi quelli interi a causa della sua superiore capacità di penetrare in profondità i tessuti con sfondo bassa fluorescenza e sensibilità segnale alto animale. 1,2 Lo spettro ristretto di due fotoni alla illuminatpunto focale ioni e l'uso di rilevatori non descanned sono le ragioni per cui due fotoni microscopia è superiore alla microscopia confocale tradizionale. Microscopia confocale non può produrre immagini di alta qualità alla profondità del tessuto necessario a causa della auto-fluorescenza e la dispersione di luce fuori fuoco nella pinhole confocale. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo che utilizza un microscopio a due fotoni per misurare [Ca 2+] i segnalazione e produzione di NO in intatti, singole cellule dei vasi sanguigni con alta risoluzione ed un basso rapporto segnale-rumore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Introduzione sperimentale. Per meglio comprendere l'apporto di calcio e NO alla fisiologia vascolare, un nuovo metodo è stato sviluppato per la misurazione [Ca 2+] i e NO all'interno muscolari lisce e cellule endoteliali dei isolate aorte intatti. Insieme, questo protocollo è composto da questi passaggi critici: 1) l'isolamento meccanico e preparazione (digestione enzimatica non) della nave. È importante mantenere il tessuto sano e intatto il più possibile avere registrazio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. William Cashdollar, e la Northwestern Mutual Foundation Imaging Center presso il Sangue Istituto di ricerca del Wisconsin per un aiuto con gli studi di imaging. Ringraziamo anche il dottor Daria Ilatovskaya per la lettura critica di questo manoscritto e utile discussione. Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HL108880 (a AS) e DP2-OD008396 (per AMG).
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
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