Live-Cell Imaging under Mechanical Stretch
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
Celler udsættes for mekaniske belastninger i mange væv, og dette mekanisk stimulering har vist sig at fremme ændringer i mønstre af genekspression, frigivelse af vækstfaktorer, cytokiner eller ombygning af den ekstracellulære matrix og cytoskelet 1-4. De intracellulære signaler transduceret fra sådanne mekaniske stimuli opstår gennem processen med mechanotransduction 5-7. I luftvejene, en resultat af mechanotransduction er stigningen i reaktive oxygenarter (ROS) 8,9 og proinflammatoriske cytokiner 10 i pulmonale epitelceller i nærvær af cyklisk trækbelastning. Stærke beviser antyder også, at overdreven trækbelastning fører til direkte skade på det alveolære epithel, udover de biokemiske reaktioner af celler 11-14. Selvom fokus her er primært på respons lungeceller til mekanisk deformation, veje induceret af mechanotransduction spille en central rolle i basic funktion af mange væv i det menneskelige legeme, herunder regulering af vaskulær tonus 15 og udviklingen af væksten pladen 16.
Den stigende interesse for mechanotransduction har resulteret i udviklingen af mange enheder for anvendelsen af fysiologisk relevante mekaniske belastninger til dyrkede celler og væv. Især indretninger anvender en trækbelastning, som er en almindelig form for mekanisk belastning opleves af væv, er populære 11,17-19. Imidlertid er mange af de tilgængelige enheder enten udformet som en bioreaktor for vævsdyrkningsapplikationer eller ikke befordrende for tidstro billeddannelse med stretch. Som sådan er der et behov for at udvikle værktøjer og metoder, der kan visualisere celler og væv i spænding for at lette efterforskningen af veje for mechanotransduction.
Heri blev en in-plane mekaniske stretching anordning designet og protokoller blev udviklet til at anvende multiple former for stamme til væv og celler, mens tillader billeddannelse af de biokemiske og mekaniske reaktioner i realtid (Figur 1A-D). Mekanismen anvender seks jævnt fordelte klemmer anbragt periferisk at gribe en fleksibel membran og anvende en i planet, radial udspilning op til ca. 20% (figur 1B). Aktiveringsindretningen kan placeres i en cellekultur inkubator i en længere periode, mens motoren (Figur 1C) er placeret uden for inkubatoren og kontrolleret af proprietær software tilvejebragt af leverandøren motor. Motoren er forbundet til en lineær driver, som roterer en intern cam, køre de seks båre klemmer ensartet i spænding og afspænding.
Ud over den mekaniske indretning, blev tilpassede fleksible membraner skabt fra kommercielt tilgængelige cellekultur klar membraner til anvendelse i det mekaniske system. Så cirkulære vægge (med en diameter på ca.28 mm) blev fremstillet og fastgjort til den fleksible membran, således at celler kunne dyrkes kun i denne region i velbeskrevet stamme profil. For at afgøre, om placeringen af disse membraner inden betjeningsindretningen ville tilvejebringe ensartede og isotrope stamme i centrum af den fleksible membran blev finite element analyse udført under anvendelse af kommercielt tilgængeligt software (Figur 1E-F). Den fleksible membran blev modelleret med symmetriske randbetingelser og udnytte alle firkantede elementer til masken. De koncentriske ringe set i kontur plot af maksimal principal stamme er vist i figur 1F angiver isotrope fordeling af stammen.
Den deformation, som membranen blev målt ved at registrere billeder af markeringer gennem loading (Figur 2). Figur 2D viser, at den gennemsnitlige membran stamme målt i radiale og aksiale retninger var tilnærmelsesvis lineærmed hensyn til den anvendte motor tæller op til en maksimal lineær belastning på 20%. Der var ingen signifikant forskel mellem de deformationsniveauer målt under udspilning i forhold til dem, der måles under tilbagetrækning tilbage til hvilestilling. Derefter blev fortrængningen af humane bronchiale epithelceller (16HBE) og deres kerner dyrket på den brugerdefinerede fleksibel membran målt. Fluorescensmærkede (DAPI) kerner af 16HBE cellerne blev filmede med en 20X målsætning under et konfokal mikroskop, mens hele celle forskydning blev målt med fase kontrast billeder optaget med en digital mikroskop. Som det ses i figur 3, stammen målt ved forskydning af kerner var svarende til den, målt ved forskydning af markeringer på membranen, indtil ~ 20% lineær belastning. Dette bekræfter, at stammen anvendt til membranerne blev fremsendt til de adhærente celler. Protokollerne beskriver brugen af den brugerdefinerede enhed på et traditionelt mikroskop og en atomic force mikroskopete findes i de følgende trin.
Protocol
Representative Results
Discussion
En unik indretning til levende celler under den mekaniske strækning blev udviklet; og denne enhed blev brugt i en protokol til at studere lunge epitel celle mechanobiology. I indledende undersøgelser blev det konstateret, at en enkelt holdt strækning stimulerede produktionen af mitokondrie superoxid i bronkiale epitelceller. Desuden blev det påvist, at forøgede niveauer af mekanisk belastning forårsaget direkte skade på integriteten af et monolag af alveolære epitelceller.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne at takke Fedex Institute of Technology på University of Memphis for deres støtte. Forfatterne vil gerne anerkende studerende på senior design projekt gruppe i Mekanik Institut ved University of Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn fra University of Memphis Engineering Technology afdeling for motorstyring og Dr. Bin Teng og Ms. Charlean Luellen for deres hjælp i cellekultur. Dette arbejde blev støttet af K01 HL120912 (ER) og R01 HL123540 (CMW).
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
References
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
