Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
Las células se someten a cargas mecánicas en muchos tejidos, y esta estimulación mecánica se ha demostrado para promover cambios en los patrones de la expresión génica, la liberación de factores de crecimiento, citoquinas, o remodelación de la matriz extracelular y el citoesqueleto 1-4. Las señales intracelulares transducidas a partir de tales estímulos mecánicos se producen a través del proceso de mechanotransduction 5-7. En el sistema respiratorio, uno de los resultados de mechanotransduction es el aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) 8,9 y citoquinas pro-inflamatorias 10 en las células epiteliales pulmonares en la presencia de deformación por tracción cíclica. Una fuerte evidencia también sugiere que la deformación por tracción excesiva conduce a dirigir lesión en el epitelio alveolar, además de las respuestas bioquímicas de las células 11-14. Aunque el enfoque aquí es principalmente sobre la respuesta de las células pulmonares a la deformación mecánica, las vías inducidas por mechanotransduction juegan un papel clave en los basic función de muchos tejidos en el cuerpo humano, incluyendo la regulación del tono vascular 15 y el desarrollo de la placa de crecimiento 16.
El creciente interés en mechanotransduction se ha traducido en el desarrollo de numerosos dispositivos para la aplicación de cargas mecánicas fisiológicamente relevantes a las células cultivadas y el tejido. En particular, los dispositivos que aplican una tensión de tracción, que es una forma común de la carga mecánica experimentada por el tejido, son populares 11,17-19. Sin embargo, muchos de los dispositivos disponibles están diseñados ya sea como un biorreactor para aplicaciones de ingeniería de tejidos o no son propicias para la formación de imágenes en tiempo real con estiramiento. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar herramientas y métodos que se pueden visualizar las células y tejidos en tensión para facilitar la investigación de las vías de mecanotransducción.
En este documento, un dispositivo de estiramiento mecánico en el plano fue diseñado y protocolos fueron desarrollados para aplicar mformas ultiple de la cepa a los tejidos y células, mientras que permiten imágenes de las respuestas bioquímicas y mecánicas en tiempo real (Figura 1A-D). El dispositivo utiliza seis pinzas uniformemente espaciadas dispuestas circunferencialmente para captar una membrana flexible y aplicar una, distensión radial en el plano a aproximadamente 20% (Figura 1B). El dispositivo de accionamiento puede ser colocado en una incubadora de cultivo celular durante un período prolongado de tiempo, mientras que el motor (Figura 1C) se coloca fuera de la incubadora y controlado por software propietario proporcionada por el proveedor del motor. El motor está conectado a un conductor lineal, que gira una leva interna, conduciendo las seis abrazaderas de camilla de manera uniforme en la tensión y la relajación.
Además del dispositivo mecánico, membranas flexibles personalizados se crean a partir de cultivo de células de las membranas disponibles comercialmente listos para ser utilizado en el sistema mecánico. Entonces paredes circulares (con un diámetro de aproximadamente28 mm) se hicieron y se une a la membrana flexible para que las células podrían ser cultivadas sólo en esta región del perfil de deformación bien descrito. Con el fin de determinar si la colocación de estas membranas dentro del dispositivo de accionamiento proporcionaría cepa uniforme e isotrópico en el centro de la membrana flexible, se realizó análisis de elementos finitos utilizando el software disponible comercialmente (Figura 1E-F). La membrana flexible se modeló con condiciones de contorno simétricas y utilizando todos los elementos cuadriláteros para la malla. Los anillos concéntricos visto en el gráfico de contorno de máxima deformación principal se muestra en la Figura 1F indican la distribución isotrópica de la cepa.
La tensión experimentada por la membrana se midió mediante la grabación de imágenes de marcas a través de la carga (Figura 2). La figura 2D muestra que la cepa promedio membrana medido en direcciones radiales y axiales era aproximadamente linealcon respecto al motor aplicado cuenta hasta una deformación máxima lineal de 20%. No hubo diferencia significativa entre los niveles de deformación medidos durante la distensión en comparación con los medidos durante la retracción de nuevo a la posición de reposo. A continuación, se midió el desplazamiento de las células humanas bronquiales epiteliales (16HBE) y sus núcleos cultivadas sobre la membrana de encargo flexible. Marcados con fluorescencia (DAPI) núcleos de las células 16HBE se obtuvieron imágenes utilizando un objetivo 20X en un microscopio confocal, mientras que el desplazamiento de célula entera se midió con imágenes de contraste de fase grabadas con un microscopio digital. Como se ve en la Figura 3, la cepa medido por el desplazamiento de los núcleos fue similar al medido por el desplazamiento de las marcas en la membrana, hasta ~ 20% de deformación lineal. Esto confirma que la deformación aplicada a las membranas se transmite a las células adherentes. Los protocolos que describen el uso del dispositivo de encargo en un microscopio tradicional y una fuerza atómica microscópicase se proporcionan en los siguientes pasos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un dispositivo único para imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico fue desarrollado; y este dispositivo se utilizó en un protocolo para estudiar mecanobiología células epiteliales de pulmón. En estudios preliminares, se encontró que un solo tramo celebrada estimuló la producción de superóxido mitocondrial en las células epiteliales bronquiales. Además, se demostró que el aumento de los niveles de tensión mecánica causaron daño directo a la integridad de una monocapa de células epitel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean que gracias Fedex Instituto de Tecnología de la Universidad de Memphis por su apoyo. Los autores desean agradecer a los estudiantes del grupo de proyecto de diseño de alto nivel en el Departamento de Ingeniería Mecánica de la Universidad de Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn desde el departamento de la Universidad de Memphis Tecnología de Ingeniería para el control del motor y el Dr. Bin Teng y la Sra Charlean Luellen por su ayuda en el cultivo celular. Este trabajo fue apoyado por K01 HL120912 (ER) y R01 HL123540 (CMW).
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
References
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