Levande cell imaging under mekanisk Stretch
Summary
A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.
Abstract
There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.
Introduction
Celler utsätts för mekanisk belastning i många vävnader, och detta mekanisk stimulering har visats främja förändringar i mönstren för genuttryck, frisättning av tillväxtfaktorer, cytokiner eller ombyggnad av den extracellulära matrisen och cytoskelettet 1-4. De intracellulära signaler omvandlade från sådana mekaniska stimuli inträffar genom processen att mechanotransduction 5-7. I andningssystemet, är ett resultat av mechanotransduction ökningen av reaktiva syreradikaler (ROS) 8,9 och pro-inflammatoriska cytokiner 10 i pulmonära epitelceller i närvaro av cykliska dragpåkänning. Starka bevis tyder också på att överdriven dragpåkänning leder till direkta skada på den alveolära epitelet, utöver de biokemiska svaren av celler 11-14. Även om fokus här är i första hand på svaret från lungceller till mekanisk deformation, vägar inducerade av mechanotransduction spelar en nyckelroll i Basic funktion av många vävnader i kroppen, inklusive regleringen av vaskulära 15 och utvecklingen av tillväxten plattan 16.
Det växande intresset för mechanotransduction har resulterat i utvecklingen av ett flertal anordningar för tillämpningen av fysiologiskt relevanta mekaniska belastningar till odlade celler och vävnad. I synnerhet enheter tillämpar en dragpåkänning, som är en vanlig form av mekanisk belastning upplevs av vävnad, är populära 11,17-19. Men många av de tillgängliga anordningar är antingen utformad som en bioreaktor för vävnadstekniska tillämpningar eller främjar inte realtid avbildning med stretch. Som sådan, det finns ett behov av att utveckla verktyg och metoder som kan visualisera celler och vävnader i spänning för att underlätta utredningen av vägar för mechanotransduction.
Häri var en i planet mekanisk sträckning anordning som är konstruerad och protokoll har utvecklats för att tillämpa multiple former av stam till vävnader och celler medan tillåter avbildning av de biokemiska och mekaniska svar i realtid (Figur 1A-D). Enheten använder sex jämnt fördelade klämmor anordnade perifer att förstå ett flexibelt membran och tillämpa en i planet, radiella utvidgning upp till ca 20% (Figur 1B). Manövreringsanordningen kan placeras i ett cellodlingsinkubator under en längre tidsperiod, medan motorn (Figur 1C) är placerad utanför inkubatorn och styrs av proprietär programvara som tillhandahålls av motorleverantören. Motorn är kopplad till en linjär förare, som roterar en inre kam, driver sex bår klämmor enhetligt i spänning och avkoppling.
Förutom den mekaniska anordningen, var anpassade flexibla membran skapade från kommersiellt tillgängliga cellodlings färdiga membran som skall användas i det mekaniska systemet. Sedan cirkulära väggar (med en diameter av ungefär28 mm) framställdes och fäst på det flexibla membranet, så att celler kunde odlas endast i denna region av väl beskrivna stammen profil. För att bestämma huruvida placeringen av dessa membran inuti manövreringsanordningen skulle ge likformig och isotrop stammen i centrum av det böjliga membranet, var finita elementanalys utfördes med användning av kommersiellt tillgänglig mjukvara (Figur 1E-F). Det flexibla membranet modellerades med symmetriska randvillkor och utnyttja alla fyrsidiga element för nätet. De koncentriska ringar ses i kontur tomt på maximalt huvudstam som visas i figur 1F ange isotrop fördelning av stammen.
Stammen upplevs av membranet mättes genom att registrera bilder av markeringar genom belastning (Figur 2). Figur 2D visar att den genomsnittliga membran stammen mätt i radiella och axiella riktningar var approximativt linjärmed avseende på det påförda motorn räknar upp till en maximal linjär stam av 20%. Det fanns ingen signifikant skillnad mellan de belastningsnivåer som uppmätts under uttänjning jämfört med dem som uppmätts under indragning tillbaka till viloläge. Därefter tillsattes förskjutningen av humana bronkiala epitelceller (16HBE) och deras kärnor odlade på den anpassade flexibla membranet mättes. Fluorescerande (DAPI) kärnor av 16HBE cellerna avbildas med en 20X mål under ett konfokalmikroskop, medan hela cell förskjutning mättes med fas kontrastrika bilder som spelats in med en digital mikroskop. Såsom framgår av fig 3, stammen mätt genom förskjutning av kärnor var liknande den som mäts genom förskjutning av markeringar på membranet, upp till ~ 20% linjär töjning. Detta bekräftar att stammen appliceras på membranen överlämnades till de vidhäftande cellerna. De protokoll som beskriver användningen av den anpassade anordningen på en traditionell mikroskop och ett atomkrafts microscope finns i följande steg.
Protocol
Representative Results
Discussion
En unik enhet för levande cell imaging under mekanisk stretch har utvecklats; och den här enheten användes i ett protokoll för att studera lung epitelceller mechanobiology. I förstudier, konstaterades det att en enda höll sträcka stimulerade produktionen av mitokondriell superoxid i bronkialepitelceller celler. Dessutom visades det att ökade nivåer av mekaniska påfrestningar orsakade direkta skador på integriteten hos ett monoskikt av alveolära epitelceller.
Att genomföra dessa …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill att tacka Fedex Institute of Technology vid universitetet i Memphis för deras stöd. Författarna vill tacka för elever i senior designprojekt grupp i Maskinteknik avdelningen vid universitetet i Memphis (David Butler, Jackie Carter, Dominick Cleveland, Jacob Shaffer), Daniel Kohn från University of Memphis Teknik avdelning för motorstyrning och Dr. Bin Teng och Ms. Charlean Luellen för deras hjälp i cellkultur. Detta arbete stöddes av K01 HL120912 (ER) och R01 HL123540 (CMW).
Materials
| SmartMotor NEMA 34: 3400 Series | MOOG Animatics | SM3416D | Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus |
| Flexcell Membrane (Collagen I coated) | Flexcell International Corp | SM2-1010C | 3.5×5.25×0.020" |
| Sylgard 184 | Dow Corning Corporation | 10:1 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H1399 | DAPI stain |
| MitoSOX | Sigma-Aldrich | M36008 | |
| Tiron | Sigma-Aldrich | D7389 | mitochondrial superoxide label |
| DMEM | superoxide inhibitor | ||
| FBS | |||
| HEPES | |||
| 50 ml tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | Any centriguge tube can be used to create an area for imaging. |
| Hybridization oven | Bellco Glass | ||
| MLE12 Cells | ATCC | CRL-2110 | Mouse Lung Epithelial Cells |
| 16HBE cells | ATCC | CRL-2741 | Human Bronchial Epithelial Cells |
| AFM Indentation Experiments | |||
| Cantilever Beams for Nano-indentation | Budget Sensors | Si-Ni30 | |
| AFM | Asylum Research | MFP3D | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-71 | Inverted microscope with 20X and 40X objectives. |
| AFM Leg Extenders | Asylum Research | Not available | AFM microscope |
| Finite Element Analyses | |||
| ABAQUS | Simulia | 6.12 | |
| Software | |||
| ImageJ | NIH | ||
| Microscopes | |||
| Digital microscope | Life Technologies | EVOS XL Core | Initially a self standing company, now owned by Life Technologies. |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | 2-photon upright microscope |
References
- Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
- Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. . Comprehensive Physiology. , (2011).
- Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
- Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
- Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
- Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
- Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
- Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
- Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
- Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
- Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells – Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
- Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
- Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
- Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
- Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
- Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
- Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
- Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
- Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
- Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
- Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
- DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).
