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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
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Immunology and Infection

「マスト細胞ノックイン」マウスを用いた生体内肥満細胞の機能解析

Published: May 27, 2015
doi:
10.3791/52753
, , , , ,
1Department of Pathology,Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology,Stanford University School of Medicine

Summary

イン ビトロ 由来肥満細胞の生成方法、肥満細胞欠損マウスへのそれらの生着、異なる解剖学的部位における生着マスト細胞の表現型、数および分布の分析について述べた。このプロトコルは、 生体内のマストセルの機能を評価するために使用することができます。

Abstract

マスト細胞(MC)は、様々な組織に存在する造血細胞であり、特に皮膚、気道、消化管などの外部環境に曝露される部位に豊富に存在する。IgE依存性アレルギー反応における有害な役割で最もよく知られているMCは、毒や侵入細菌や寄生虫に対するホスト防御の重要なプレーヤーとしても出現しています。MC表現型および機能は、解剖学的位置によって異なる可能性がある微小環境要因、または免疫応答の発達のタイプまたは段階に基づいて影響を受ける可能性がある。このため、MC機能に関する洞察を得るために、インビトロ法よりもインビボアプローチを支持してきました。ここでは、マウス骨髄由来培養MC(BMC)の生成方法、遺伝的MC欠損マウスへの導入、異なる解剖学的部位における養子転移の数と分布の分析について述べた。この方法は、”マストセルノックイン”アプローチと名付けられ、過去30年間、生体内のMCおよびMC由来製品の機能を評価するために広く使用されてきました。近年開発された代替アプローチに照らして、この方法の利点と限界について議論する。

Introduction

マスト細胞(MC)は、多能性骨髄前駆物質1-3から生じる造血細胞である。骨髄の進入に続いて、MCの前駆体は、局所的な成長因子1-3の影響を受けて成熟したMCに発展する様々な組織に移行する。組織常駐型のMCは、皮膚、気道、胃腸管などのホスト環境のインターフェースに戦略的に位置し、外部侮辱に対する第一線の防御線として3-6と動作する。多くの場合、MCは「ベースライン」の表向きの特性と解剖学的位置に基づいてサブ分類されます。マウスでは、「結合組織型」のMC(CTMC)および粘膜MC(MC)1~3,7,8という2種類のMCが記載されている。CTMCは、しばしば、小脳および神経線維の近くに位置し、滑膜腔に存在し、MMCは腸内および呼吸粘膜1-3の上皮内位置を占める。

多くの方法論が、MC9-13の生物学的機能を研究するために適用されてきた。多くのグループは、細胞株(ヒトMCラインHMC114またはLAD215,16など)、インビトロ由来MC(ヒト末梢血由来MC17、マウス骨髄由来など)のいずれかを使用してインビトロアプローチに焦点を当てています。 培養したMC[BCMCs]18、胎児皮膚由来培養MC[FSCCs]19および腹膜細胞由来MC[PCMC]20)または異なる解剖学的部位から単離されたMC。これらのモデルはすべて、MC活性化に関与するシグナル伝達経路など、MC生物学の分子的詳細を研究するために広く使用されています。しかし、MC生物学の重要な側面は、その表現型および機能的特性(例えば、細胞質顆粒プロテアーゼ含有量または異なる刺激に対する応答)が解剖学的位置および微小環境2,7によって変調され得る点である。生体内で遭遇するこのような要因の正確な混合物は、in vitroで再現することが困難な場合があるので、我々は、MC機能9に関する洞察を得るためにin vivoアプローチを使用して好む。

遺伝的MC欠乏症を有する複数のマウス株が存在し、広く使用されているWBB6F1-キットW/W-vまたはC57BL/6-キットW-sh/W-shマウスなど。これらのマウスはKIT(CD117)の発現および/または活性を欠いているが、主MC成長因子幹細胞因子(SCF)21,22の受容体である。その結果、これらのマウスは深いMC欠乏症を有するが、また、c−キット突然変異(WBB6F1-キットW/W-vマウス)またはc-キット発現の減少をもたらす大きな染色体反転の影響(C57BL/6-キットW-sh-C-s)9,122222222222222222222年12月12日に関連する表現型異常を有する。さらに最近では、c-キット-独立した構成MC欠乏症を有するマウスのいくつかの株が24-26に報告されている。これらすべてのマウスおよびいくつかの追加の新しいタイプの誘導可能なMC欠乏マウスは、最近詳細に9,10,13で見直された。

ここでは、マウス骨髄由来培養MC(BMC)の生成方法、MC欠損マウスへの導入、異なる解剖部位における養子転移MCの数と分布の分析について述べた。このいわゆる 「マストセルノックイン」 法は 、生体内のMCおよびMC由来製品の機能を評価するために使用することができます。近年開発された代替アプローチに照らして、この方法の利点と限界について議論する。

Protocol

すべての動物のケアと実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従い、スタンフォード大学の制度的動物ケアと使用委員会の具体的な承認を得て行われました。 1. 骨髄由来培養マスト細胞(BMC)の生成と特性評価 注:ドナーBMCCsは、レシピエントMC欠損マウスと同じ遺伝的背景の骨髄細胞から生成されるべきである。男性由来ドナーBMCは、雌マウスの生着?…

Representative Results

「マスト細胞ノックイン」アプローチの概要を 図1に示し、BMCの生成、MC欠乏マウスに生着する細胞の数(実験計画に基づいて示された数を変更することができます)、および注入部位に応じて着実と実験の間隔(この場合は異なる場合)が含まれています。 例えば、MC細胞質顆粒中の保存されたメディエーターの含有量は、時間38と共に着実に増加する。 ?…

Discussion

最初の説明 38 から約30年が経過したところで、”マスト セル ノックイン” アプローチは、MC が生体内で何ができるか、または何ができないかについての貴重な情報を提供し続けています。MCの機能は長い間アレルギーにおけるその役割に限定されると考えられていた。「マスト細胞ノックイン」アプローチを用いて生成されたデータは、MCが他の機能の中で、特定?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.G.はフランスの「フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカルFRMを注ぐ」とフィリップ財団からのフェローシップの受領者です。R.S.は、ルシル・パッカード小児健康財団とスタンフォードNIH/NCRR CTSA賞番号UL1 RR025744によってサポートされています。P.S.はマックスケイド財団のマックスケイドフェローシップとオーストリア科学アカデミー、オーストリア科学基金(FWF):J3399-B21のシュレーディングフェローシップによってサポートされています。S.J.G.は、国立衛生研究所の助成金U19 AI104209、NS 080062、およびカリフォルニア大学のタバコ関連疾患研究プログラムからの支援を認めています。L.L.R.は、関節炎国立研究財団(ANRF)と国立衛生研究所助成金K99AI110645からの支援を認めています。

Materials

1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30G x1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1 % Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03
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Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using ‘Mast Cell Knock-in‘ Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).
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