JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Analysere funksjonene til mastceller In Vivo ved hjelp av 'Mast Cell Knock-in' Mus

Published: May 27, 2015
doi:
10.3791/52753
, , , , ,
1Department of Pathology,Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology,Stanford University School of Medicine

Summary

Vi beskriver en metode for generering av in vitro-avledede mastceller, deres engraftment i mastcellemangelmus, og analysen av fenotypen, tallene og fordelingen av engraferte mastceller på forskjellige anatomiske steder. Denne protokollen kan brukes til å vurdere funksjonene til mastceller in vivo.

Abstract

Mastceller (MCs) er hematopoietiske celler som ligger i ulike vev, og er spesielt rikelig på steder utsatt for det ytre miljø, som hud, luftveier og mage-tarmkanalen. MCs er best kjent for sin skadelige rolle i IgE-avhengige allergiske reaksjoner, og har også dukket opp som viktige aktører i vertsforsvaret mot gift og invaderende bakterier og parasitter. MC fenotype og funksjon kan påvirkes av mikromiljøetrementale faktorer som kan variere i henhold til anatomisk plassering og/eller basert på type eller stadium av utvikling av immunresponser. Av denne grunn har vi og andre favorisert in vivo-tilnærminger over in vitro-metoder for å få innsikt i MC-funksjoner. Her beskriver vi metoder for generering av musebenmarg-avledede kultiverte MCs (BMCMCs), deres adoptivoverføring til genetisk MC-mangelfulle mus, og analysen av antall og distribusjon av adoptivt overførte MCer på forskjellige anatomiske steder. Denne metoden, kalt‘mast cell knock-in’ tilnærming, har blitt mye brukt de siste 30 årene for å vurdere funksjonene til MCs og MC-avledede produkter in vivo. Vi diskuterer fordelene og begrensningene ved denne metoden, i lys av alternative tilnærminger som er utviklet de siste årene.

Introduction

Mastceller (MCs) er hematopoietiske celler som oppstår fra pluripotente benmargsforfedre1-3. Etter benmargsegresjon migrerer MCs forfedre inn i ulike vev der de utvikler seg til modne MCs under påvirkning av lokale vekstfaktorer1-3. Vev-bosatte MCs er strategisk plassert på vertsmiljøgrensesnitt, for eksempel huden, luftveiene og mage-tarmkanalen, hvor de oppfører seg som en første forsvarslinje mot eksterne fornærmelser3-6. MCs er ofte sub-klassifisert basert på deres “baseline” fenotypiske egenskaper og deres anatomiske steder. Hos mus er to typer MCer beskrevet: “bindevevstype” MCs (CTMCer) og mucosal MCs (MMCs)1-3,7,8. CTMCer er ofte plassert rundt venules og nær nervefibre, og ligger i serosale hulrom, mens MMCer opptar intraepitheliale steder i tarmen og respiratorisk slimhinne1-3.

Tallrike metoder er brukt for å studere biologiske funksjoner i MCs9-13. Mange grupper har fokusert på in vitro-tilnærminger ved hjelp av enten cellelinjer (for eksempel de menneskelige MC-linjene HMC114 eller LAD215,16), in vitro-avledede MCer (for eksempel human perifere blodavledede MCer17eller musebenmarg – avledet dyrket MCs [BMCMCs]18, fetal hud-avledet kultivert MCs [FSCMCs]19 og peritoneal celle-avledet MCs [PCMCs]20) eller ex vivo isolerte MCs fra ulike anatomiske nettsteder. Alle disse modellene er mye brukt til å studere molekylære detaljer om MC-biologi, for eksempel signalveier involvert i MC-aktivering. Et viktig aspekt ved MCs biologi er imidlertid at deres fenotypiske og funksjonelle egenskaper (f.eks.cytoplasmisk granulatproteaseinnhold eller respons på forskjellige stimuli) kan moduleres ved anatomisk plassering og mikromiljø2,7. Siden den eksakte blandingen av slike faktorer som oppstår in vivo kan være vanskelig å reprodusere in vitro, favoriserer vi å bruke in vivo tilnærminger for å få innsikt i MCs funksjoner9.

Flere musestammer med genetisk MC-mangel eksisterer, for eksempel de mye brukte WBB6F1–Kit W / W-v eller C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh mus. Disse musene mangler uttrykk og/eller aktivitet av KIT (CD117), reseptoren for den viktigste MC-vekstfaktor stamcellefaktoren (SCF)21,22. Som et resultat har disse musene en dyp MC-mangel, men har også ytterligere fenotypiske abnormiteter relatert til deresc-kit mutasjoner (i WBB6F1–Kit W / W-v mus) eller til effekten av den store kromosomale inversjon som resulterer i redusert c-kit uttrykk (i C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh mus) 9,10,12,23. Mer nylig har flere stammer av mus medc-kit-uavhengig konstituerende MC-mangel blitt rapportert24-26. Alle disse musene og noen ekstra nye typer inducible MC-mangelfulle mus har nylig blitt gjennomgått i detalj9,10,13.

Her beskriver vi metoder for generering av musebenmarg-avledede dyrkede MCs (BMCMCs), deres adoptivoverføring til MC-mangelfulle mus, og analysen av antall og distribusjon av adoptivt overførte MCs på forskjellige anatomiske steder. Denne såkalte “mast cell knock-in” -metoden kan brukes til å vurdere funksjonene til MCs og MC-avledede produkter in vivo. Vi diskuterer fordelene og begrensningene ved denne metoden, i lys av alternative tilnærminger som er utviklet de siste årene.

Protocol

All dyrepleie og eksperimentering ble utført i samsvar med retningslinjene fra National Institutes of Health og med den spesifikke godkjenningen av Institutional Animal Care and Use Committee ved Stanford University. 1. Generering og karakterisering av benmarg-avledede dyrkede mastceller (BMCMCer). Merk: Donor BMCMCs bør genereres fra benmargsceller med samme genetiske bakgrunn som mottakeren MC-mangelfulle mus. Mannlig-avledet donor BMCMCs er ikke egnet for engraft…

Representative Results

En oversikt over’mastcelle knock-in’ tilnærming vises i figur 1, og inkluderer generering av BMCMCer, antall celler som skal være engrafted i.p., dvs. eller i.v. i MC-mangelfulle mus (antallet kan varieres hvis angitt basert på eksperimentell design) og intervallet mellom engraftment og eksperiment avhengig av injeksjonsstedet (dette intervallet kan også variere, hvis angitt; f.eks.øker innholdet av lagrede mediatorer i MC-cytoplasmatiske granulater jevnt med tiden38). <…

Discussion

Nesten 30 år etter den første beskrivelsen38fortsetter“mastcelle knock-in” -tilnærmingen å gi verdifull informasjon om hva MCer kan gjøre eller ikke kan gjøre in vivo. Funksjonene til MCs ble lenge antatt å være begrenset til deres rolle i allergi. Data generert ved hjelp av‘mast celle knock-in‘ tilnærming har endret denne visningen, ved å gi bevis på at MCs kan, blant andre funksjoner, spille kritiske roller i vertsforsvar mot visse patogener4,39 eller giftstof…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.G. er mottaker av stipendiater fra den franske “Fondation pour la Recherche Médicale FRM” og Philipp Foundation; R.S. støttes av Lucile Packard Foundation for Children’s Health og Stanford NIH/NCRR CTSA-tildelingsnummer UL1 RR025744; P.S. støttes av et Max Kade Fellowship fra Max Kade Foundation og Det østerrikske vitenskapsakademiet og et Schroedinger Fellowship of the Austrian Science Fund (FWF): J3399-B21; S.J.G. anerkjenner støtte fra National Institutes of Health tilskudd U19 AI104209, NS 080062 og fra Tobacco-Related Disease Research Program ved University of California; L.L.R. anerkjenner støtte fra Arthritis National Research Foundation (ANRF) og National Institutes of Health grant K99AI110645.

Materials

1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30G x1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1 % Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as ‘tunable’ effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models – Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. ‘Sash’ mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Tags

Mast CellsIn VivoKnock-in MiceBone Marrow-derived Cultured Mast CellsAdoptive TransferAnatomical DistributionHost DefenseAllergic Reactions
check_url/52753?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using ‘Mast Cell Knock-in‘ Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image