L'utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

Summary

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Abstract

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta–catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Introduction

Il pesce zebra è una ben consolidata organismo modello vertebrato per studiare molti aspetti dello sviluppo, fisiologia, patologia, e la rigenerazione. Con la crescente adozione di zebrafish come modello per i processi biologici post-embrionali, strumenti sperimentali per, la manipolazione inducibile tessuto-specifica dell'espressione genica o vie di segnalazione sono diventati sempre più importanti. In particolare, gli studi in organo e rigenerazione appendice in zebrafish adulti hanno sofferto di una mancanza di strumenti per la dissezione dei requisiti spazio-temporali di vie di segnalazione durante questi processi rigenerativi.

Attualmente, tre diversi sistemi sono stati utilizzati per realizzare condizionale, espressione tessuto-specifica del gene in rigenerazione organi di zebrafish adulto: il sistema Cre-lox, espressione mosaico di heat-shock transgeni inducibile mediante trasposoni mediata transgenesi somatica, e il sistema di Teton ^{1 -3.} TETON riferisce ad una variante di un tetraciclina-CONTlaminati sistema di attivazione trascrizionale, dove l'espressione viene attivato in presenza di tetraciclina o un suo derivato, ad esempio doxiciclina. Il sistema Cre-lox, come è finora stato utilizzato in pesci adulti, si basa su un ricombinasi Tamoxifen controllato Cre (CreERT2), la cui espressione è spazialmente limitata da elementi regolatori tessuto-specifici. Rimozione Cre-driven di una cassetta di STOP facilita l'espressione del gene di interesse guidata da un promotore che deve essere attiva in tutti i tipi cellulari ^1. Creazione Transposon mediata di transgeni somatiche mosaically espresse offre un sistema di espressione del transgene inducibile in linee cellulari individuali. Iniezione di embrioni di zebrafish con trasposone Tol2 che porta un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale di un shock termico risultati promotore in individui chimerici tipicamente portano il transgene solo in linee cellulari discreti di un organo rigenerante ^2. Mentre entrambi i sistemi permettono condizionale tessuti speespressione genica fica, il sistema Cre-lox non è reversibile, e la strategia di utilizzo di etichettatura clonale basato trasposoni-risente della sua natura stocastica. Così, noi ed altri hanno recentemente adattato sistemi Teton transgenici per l'utilizzo in zebrafish, che facilitano temporalmente e l'espressione genica spazialmente controllata che si aggiunge sintonizzabile e reversibile ^3-5.

Il sistema di Teton qui utilizzato comprende una linea pilota transgenica (TetActivator), in cui un Doxiciclina (DOX) -inducible attivatore trascrizionale (migliorato transattivatore tetraciclina inverso, irtTA, breve Teta) è sotto il controllo di sequenze regolatorie genomiche tessuto-specifici. In secondo luogo, esso richiede una linea transgenica responder (TetResponder) che ospita un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale del gestore tetraciclina (Tet elemento di risposta; tetre) (Figura 1A). Pertanto, l'uso di combinazioni specifiche di linee TetActivator e TetResponder consente condizionale tessuto-specificomanipolazione fic dell'espressione genica.

Abbiamo recentemente utilizzato il sistema di Teton a sondare per le funzioni di tessuto-specifici di Wnt segnalazione / beta-catenina nell'adulto rigeneranti coda zebrafish fin ^3. Nel protocollo descritto qui si descrive un flusso di lavoro per la messa a punto e l'uso del sistema di Teton in zebrafish, in particolare per gli studi di rigenerazione fin. Questo include le istruzioni dettagliate su come generare linee TetActivator e TetResponder transgeniche stabili e di un protocollo per l'induzione transgene in embrioni e zebrafish adulto. Inoltre, si descrivono tecniche per la verifica dell'espressione genica tessuto-specifica nel rigenerato aletta, compreso un protocollo per la preparazione di criosezioni di pinne zebrafish adulti. Inoltre, si discute considerazioni per la progettazione del transgene TetActivator, la scelta di un metodo di transgenesi e rilevamento di espressione TetResponder. Quindi, l'obiettivo generale di questo protocollo è quello di servire da modelloprevista per il montaggio di un sistema téton funzionale zebrafish per ottenere l'espressione genica condizionale tessuto-specifico, che può essere applicato a qualsiasi tessuto di interesse.

Abbiamo creato un vettore TetActivator consentendo I-SCEI o generazione Tol2 mediata delle linee TetActivator stabili utilizzando sequenze di regolazione genomica brevi (frammenti enhancer; Weidinger laboratorio banca dati plasmide no 1247;. Figura 1B). Questo costrutto contiene una cassetta TetActivator consistente della variante mutante M2 del dominio repressore Tet inverso fuso con il virus Herpes simplex VP16 transattivazione dominio derivato 3F [irtTAM2 (3F)]. Espressione dei TetActivator (TETA) può essere facilmente monitorato dal momento che è co-espressa con il fluoroforo AmCyan dalla stessa griglia di lettura aperta; un peptide P2A media ribosomiale per saltare, che dovrebbe portare la produzione di Teta e AmCyan proteine ​​separate a un rapporto 1: 1 ^5,6. Il costrutto contiene anche un poylinker 5 'del Tcassette etActivator per facilitare l'inserimento di genomica sequenze regolatrici di interesse utilizzando metodi di clonazione convenzionali.

Inoltre, abbiamo creato un costrutto costituito dal cassetto sopra descritto TetActivator più una cassetta di selezione kanamicina (Weidinger database di plasmide laboratorio no 1180;. Figura 1C), che possono essere ricombinati in un cromosoma artificiale batterico (BAC) contenente una grande regione genomica ( di solito nel codone di inizio di un gene la cui espressione modello deve essere imitata dal transgene). Entrambi i costrutti sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta.

Protocol

1. Generazione di transgeniche TetActivator pesce Lines Generazione di TetActivator costrutto Clone sequenze regolatrici di interesse monte della cassetta TetActivator nel vettore # 1247 utilizzando tecniche standard. In alternativa, utilizzare tecniche di ricombinazione per generare un BAC, in cui la cassetta TetActivator (vector # 1180) è inserito nel primo esone del gene bersaglio, e dove il Tol2 invertita ripetizioni sono introdotti nel backbone BAC (per un protocollo recombineering dettagliata …

Representative Results

Per stabilire un sistema di Teton funzionale per l'espressione del gene inducibile tessuto-specifica, TetActivator transgenici e linee TetResponder bisogno di essere generato (Figura 1A). Questo si ottiene microinjecting TetActivator (Figura 1B – C) o TetResponder (Figura 1E) costruisce in embrioni di zebrafish e la successiva integrazione della linea germinale. Costrutti TetActivator funzionali possono essere generati sia per clonazione di brevi se…

Discussion

Il zebrafish adulto ha una straordinaria capacità di rigenerare con successo molti organi interni e appendici. Una conoscenza approfondita dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti richiede un'analisi tessuto-specifica delle funzioni dei geni e vie di segnalazione. Verso questo, il sistema di Teton fornisce un efficace strumento per l'espressione genica controllata spatiotemporally in zebrafish embrionali e adulte. I costrutti sistema Teton e metodologie descritte in questo manoscritto sono stati utilizza…

Materials

Breeding boxes	Aqua Schwarz	AquaBox 1
Compound fluorescent microscope	e.g. Leica, Zeiss	varies with the manufacturer	to image fluorescent tissue sections
Confocal microscope	e.g. Leica, Zeiss	varies with the manufacturer	to image fluorescent tissue sections
Cryostat	e.g. Leica, Thermo-Scientific	varies with the manufacturer	for cryosectioning
4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi)	Sigma-Aldrich	D9542	use 1/5000 in PBS for visualization of nuclei
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891	prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction
E3 embryo medium			5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2· 2 H2O, 0.33 mM MgSO4·7 H2O, 0.2 ‰ (w/v) methylene blue, pH 6.5 for embryo/larvae husbandry
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation
1x Phosphat-buffer saline (PBS)			1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5
1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)			1x PBS with 0.1 % Tween 20
Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides	Thermo Scientific	1014356190	for collection of tissue sections
Stereo fluorescent microscope	e.g. Leica, Zeiss	varies with the manufacturer	for fluorescence-based genotyping
Thermocycler	e.g. Biorad, Applied Biosystems	varies with the manufacturer	for PCR-based genotyping
Tissue freezing medium (TFM)	Triangel Biomedical Sciences	TFM-C	for embedding of tissue samples
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium