Использование Титон системы для изучения молекулярных механизмов регенерации данио рерио
Summary
Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.
Abstract
The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta–catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.
Introduction
Данио является хорошо создана позвоночных модельный организм для изучения многих аспектов развития, физиологии, болезни, и регенерации. С ростом принятия данио в качестве модели для пост-эмбриональных биологических процессов, экспериментальных инструментов для индуцибельного, тканеспецифической манипуляции экспрессии генов или сигнальных путей становятся все более важными. В частности, исследования в органе и придатков регенерации в взрослых данио пострадали от отсутствия инструментов для вскрытия пространственно-временная требованиям сигнальных путей во время этих регенеративных процессов.
В настоящее время три различные системы были использованы для достижения условное, тканеспецифичную экспрессию генов в регенерации органов взрослых данио: система Cre-LOX, мозаичную экспрессию теплового шока индуцируемых трансгенов использованием транспозонов-опосредованной соматической трансгенеза, и систему TETON 1 -3. Титон относится к варианту тетрациклина-продолжениепроката транскрипции система активации, где выражение активируется в присутствии тетрациклина антибиотик или производным, например доксициклин. Система Cre-LOX, как это до сих пор используется в взрослых рыб, опирается на Тамоксифен контролируемой Cre рекомбиназой (CreERT2), экспрессия которого пространственно ограничено регуляторных элементов ткане-специфических. Cre приводом удаление СТОП кассеты облегчает экспрессию интересующего гена с приводом от промотора, который должен быть активным во всех типах клеток 1. Транспозонов-опосредованной создание мозаично выраженных соматических трансгенов обеспечивает систему для индуцируемой экспрессии трансгена в отдельных клеточных клонов. Введение эмбрионов данио рерио с транспозона, несущего Tol2 представляющий интерес ген под транскрипционным контролем промотора теплового шока приводит к химерных особей, как правило, несущих трансген только в дискретных клеточных клонов в регенерирующей органа 2. В то время как обе системы позволяют условного ткани-SPEэкспрессия генов специфичны, система Cre-LOX не является обратимым, и стратегия с использованием транспозонов основе клонального маркировки страдает от его стохастического характера. Таким образом, мы и другие недавно адаптированы трансгенных систем Титон для использования в данио, которые облегчают времени и пространстве, контролируемая экспрессия генов, что в дополнение перестраиваемой и обратимой 3-5.
Система Титон используется здесь включает в себя трансгенной линии драйвера (TetActivator), в котором доксициклин (DOX) -inducible активатор транскрипции (улучшенный обратный тетрациклина трансактиватор, irtTA, короткие Тета) находится под контролем регуляторных последовательностей генома тканеспецифических. Во-вторых, это требует трансгенной линии ответчика (TetResponder), что таит в себе интерес ген под транскрипционным контролем оператора тетрациклина (TET элемент ответа; TetRE) (1А). Таким образом, использование специфических комбинаций TetActivator и TetResponder линий позволяет условного ткани-SPECIфик манипуляции экспрессии генов.
Мы недавно использовали Титон систему, чтобы зонд для тканеспецифических функций Wnt / бета-катенина сигнализации у взрослых данио регенерации хвостовой плавник 3. В протоколе, изложенной здесь мы описываем рабочий поток для настройки и использования системы Титон у рыбок данио, в частности, для исследований плавника регенерации. Это включает в себя подробные инструкции о том, как генерировать стабильные трансгенных TetActivator и TetResponder линии и протокол для трансгенной индукции у эмбрионов и взрослых данио. Кроме того, мы опишем методы для проверки экспрессии генов тканеспецифической в ребра регенерата, в том числе протокола для подготовки криосрезов взрослых данио плавников. Кроме того, мы обсудим соображения для конструкции TetActivator трансгена, выбор метода трансгенеза и обнаружения экспрессии TetResponder. Следовательно, общая цель этого протокола, чтобы служить в качестве планаДля наладки функциональную систему TETON в данио достичь экспрессии гена условное тканеспецифичную, который может быть применен к любой интересующей ткани.
Мы создали TetActivator вектор, позволяющий для I-SCEI или Tol2-опосредованной поколения устойчивых TetActivator линий с использованием коротких геномных последовательностей, регулирующих (энхансерные фрагменты; Вайдингер лаборатории базы данных плазмиды нет 1247;. 1В). Эта конструкция содержит кассету, состоящую из TetActivator М2 мутантного варианта обратной Tet-репрессора области слита с вирусом простого герпеса VP16 трансактивации домена производная 3F [irtTAM2 (3F)]. Экспрессия TetActivator (Тета) можно легко контролировать, поскольку она является совместной экспрессии с флуорофором AmCyan из той же открытой рамке считывания; p2a пептид опосредует рибосом пропуск, который должен привести к производству Тета и AmCyan как отдельных белков в соотношении 1: 1 отношение 5,6. Конструкция также содержит poylinker 5'-TetActivator кассеты для облегчения введения геномных регуляторных последовательностей, представляющих интерес с использованием обычных методов клонирования.
Кроме того, мы создали конструкцию, состоящую из описанной выше кассеты TetActivator плюс выбор кассеты канамицину (Weidinger лабораторной плазмиды базе данных нет 1180;. Рис 1С), который может быть объединяется в бактериальной искусственной хромосомы (ВАС), содержащего большое области геномной ( Обычно в старт-кодоном гена, экспрессия образец должен быть имитируется трансгена). Обе конструкции доступны из лаборатории Weidinger по запросу.
Protocol
Representative Results
Discussion
Взрослый данио обладает удивительной способностью успешно регенерировать много внутренних органов и придатков. Глубокое понимание молекулярных и клеточных механизмов, участвующих требуется тканеспецифичную анализ функций генов и сигнальных путей. К этому, система Титон обеспечива…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Криста Гаазе, Дорис Вебер и Брижит Korte для оказания технической помощи. Работа в лаборатории Weidinger поддерживается грантами Немецкого исследовательского WE 4223 / 3-1, мы 4223 / 4-1 и Немецким обществом по Kardiologie через Oskar-Lapp-стипендию и Клаус-Георг-унд-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g. Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| E3 embryo medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2· 2 H2O, 0.33 mM MgSO4·7 H2O, 0.2 ‰ (w/v) methylene blue, pH 6.5 for embryo/larvae husbandry |
||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1 % Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g. Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, (2007).
