Protocol
1.净化染料
- 通过将0.4g污点粉末在10ml蒸馏水制备甲基绿的4％水溶液。调匀，直至完全溶解它。
- 在通风罩，具有至少2份氯仿混合。事先检查管是否氯仿抗性是重要的。
- 调匀，离心1分钟，在2000 XG加速相分离。
- 离心后，上层水相用甲基绿，并用氯仿下部的有机相和通常的杂质结晶紫被获得。
- 恢复上相和，直到下阶段似乎完全没有结晶紫重复此步骤。
- 在结束时，上层相回收并用水稀释至2％甲基绿的最终浓度。此原液是稳定在工作台上数月，不需要避光。
- 固定在磷酸盐缓冲盐水（PBS）将胚过夜在4％甲醛（从多聚甲醛）。
注意：这可能需要从几个小时至过夜取决于胚的厚度。在这个例子中，我们固定48小时后受精（HPF）斑马鱼的胚胎过夜。 - 在PBS-T（1％的Triton X-100的PBS）中5分钟洗胚胎三次。升高浓度的洗涤剂permeabilizes角质层。
- 制备1：5,000-1：于PBS-T的万溶液甲基绿的（从2％原液）。洗涤剂的温育过程中的存在对于厚的样品，如斑马鱼的胚胎和幼虫是有用的。
- 孵育至少6小时，溶液中的胚胎在4℃下，用温和的摇摆。再次，胚胎的厚度为保温时间校准参数。
- 洗胚胎3恬西文用PBS 30分钟以除去洗涤剂过量。当结合于DNA甲基绿荧光只有明显，与未结合的分子，因此背景是微不足道的。
- 在山出土的幻灯片或自制室安装液（75％甘油，0.1米的Tris·HCl的pH值为8）。
注意：如果核染色免疫标记后进行，甲基绿可以合并到工作浓度的安装解决方案，而无需冲走。 - 店内冷藏或立即启动成像。用激光扫描共聚焦（或其它荧光）显微镜激发在设定为650-750毫微米考虑到甲基绿色发射在677毫微米达到其最大登记633纳米和发射滤光片进行摄像。
注意：我们提供了甲基绿色发射轮廓的测量数据，也可以装载到采集软件，作为补充材料。
3.荧光核圣使用甲基绿全鸡胚癌宁
- 孵育受精鸡蛋到感兴趣的阶段。过夜在4％甲醛（从仲甲醛）的PBS固定的胚胎在4℃。在PBS-T 2小时洗胚胎3次。
- 制备1：5,000-1：于PBS-T的万溶液甲基绿的（从2％原液）。孵育在染色液胚胎过夜，在4℃。洗胚胎3次在PBS中，每1小时。安装在腔室用75％甘油，0.1M的Tris，pH为8。
4.成像荧光标记的细胞核中全安装胚胎
- 通过坚持电气胶带几层在显微镜载玻片，并仔细制备成像室切孔进入它用手术刀以放置胚胎内。这将防止胚胎成像过程中破碎。
- 小心地将胚胎室75％甘油，0.1M的Tris-HCl，pH值为8转移到成像室，并填写顶端到空洞形成气泡。
- 盖上＃0盖玻片避免或消除介质四溢。指甲油密封。
- 获取标本的图像上搭载了633激发滤光片或激光线荧光显微镜。
注：排放过滤器应涵盖677最大发射甲基绿的。
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Representative Results
厚标本核染色。本文描述的协议允许实现深层结构整体胚胎均匀染色。显影透镜晶核形式48 HPF斑马鱼胚胎中均匀标记（ 图1）。
甲基绿DNA染色允许的细胞周期依赖性的形态差异判别如核分裂或凋亡细胞核（ 图2A）的鉴定。在高分辨率亚核结构也是明显所示为斑马鱼胚胎（ 图2B）的表皮细胞核。
甲基绿是耐在高强度照射光漂白的时间延长周期。当用633纳米激光在同一强度照射，甲基绿核染色不漂白出来，因为它是另一种DNA特异性染色共享相似的光谱特征的情况下，TO-PRO-34。一个整体式的斑马鱼胚胎的视网膜的共焦面被选择并放大具有63×1.4NA物镜，以实现高的照射。缩小时，样品染色的TO-PRO-3表明60秒连续照射（ 图3，上图）的范围内漂白，同时染色甲基绿的标本显示在相同条件下漂白甚至在120秒没有可见证据（ 图3，下图）。在拉萨夫软件获取的图像进行进一步处理（亮度/对比度;三维重建;最大强度投影）斐济使用开放源码软件（http://fiji.sc/）。
图1：用甲基绿深层结构的均匀核染色在Z投影物O开发一个48 HPF斑马鱼胚胎沾上甲基绿（MG）的镜头F 20飞机共聚焦。胚胎进行复为F-肌动蛋白与TRITC标记的鬼笔（蝴蝶兰）。比例尺：15微米。
图2：核形态和甲基绿染色 A）在48 HPF斑马鱼胚胎的表皮不同形态的核亚核分辨率。 MG，甲基绿。标本进行复为F-肌动蛋白与TRITC - 鬼笔。箭头：有丝分裂细胞。 10架飞机共聚焦最大强度投影。 B）的鸡胚神经板标示以相同的方式，显示有丝分裂的细胞（箭头）和固缩核（箭头）。单焦面。 C）一个斑马鱼胚胎的表皮细胞核在高放大倍率，显示出亚核分辨率的高度三单共焦面。比例尺：A，15微米; B，5微米; C，1微米。
图3：连续激发下甲基绿的光稳定性的TO-PRO-3染色48 HPF斑马鱼视网膜细胞核进行漂白后60秒连续激发的在633nm处（上图）。在相同条件下，甲基绿染色的胚胎（MG）没有表现出可察觉的漂白，复制的曝光时间（下图）时也是如此。漂白和采集被扫描在单架飞机，在8000赫兹，30％的激光功率和线（×2）和框架（4个）平均。比例尺：30微米。
| 波长（nm） | ％的排放量 |
| 640 | 21.37 |
| 643 | 27.5 |
| 646 | 36.69 |
| 44.47 | |
| 652 | 53.92 |
| 655 | 61.82 |
| 658 | 67.86 |
| 661 | 83.2 |
| 664 | 85.22 |
| 667 | 89.45 |
| 670 | 87.33 |
| 673 | 92.3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97.41 |
| 682 | 90.34 |
| 685 | 83.32 |
| 78.37 | |
| 691 | 76.09 |
| 694 | 73.95 |
| 697 | 67.36 |
| 700 | 64.4 |
| 703 | 61.26 |
| 706 | 56.39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49.56 |
| 715 | 46.12 |
| 718 | 41.4 |
| 721 | 38.8 |
| 724 | 35.97 |
| 33.27 | |
| 730 | 30.95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23.3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| 751 | 17.47 |
| 754 | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12.45 |
| 763 | 11.49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7.55 |
| 772 | 7.75 |
| 775 | 6.46 |
| 778 | 5.76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
补充材料1：甲基绿核染色下633 nm激发发射光谱。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
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