JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Published: April 29, 2015
doi:
10.3791/52771
,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Michigan, 2Biointerfaces Institute,University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering,University of Michigan

Summary

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Abstract

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

Introduction

פיתוח חיסון מסורתי בעיקר העסיק את הגישה האמפירית של ניסוי וטעייה. עם זאת, עם ההתפתחות האחרונה של מגוון רחב של ביו-חומרים וגילוי של גורמים מולקולריים של הפעלה חיסונית, ניתן כיום לעצב באופן רציונלי ניסוחים חיסון עם רמזי biophysical וביוכימיים הנגזרים מגורמי המחלה 1,2. בפרט, פלטפורמות משלוח הסמים חלקיקים שונות נבדקו כנישאי חיסון כפי שהם יכולים להיות שותף מלא באנטיגנים מקטע וסוכני immunostimulatory, להגן על רכיבי חיסון משפלה, ולשפר את שיתוף מסירתם לאנטיגן תאי מציגים (נגמ"שים) המתגוררים בהלימפה בלוטות (LNs), ובכך למקסם את הגירוי וההפעלה 3-5 חיסוניים. בדו"ח זה, אנו מתארים את הסינתזה של מערכת "מחקה לפתוגן" ננו-חלקיקים, המכונה שלפוחית ​​interbilayer-crosslinked multilamellar (ICMVs), שכבר הוכיח בעבר כplatfor חיסון חזקמ 'לדיבוב של הלימפוציטים חזקים T ציטוטוקסי (CTL) ותגובות חיסוניות הלחות בשני תאי רקמה מערכתיים ורירית 6-9. בפרט, חיסון עם ICMVs הושג משופר באופן משמעותי את רמות נוגדנים בסרום נגד אנטיגן מלריה, בהשוואה לחיסון עם adjuvants הקונבנציונלי (לדוגמא, אלום וMontanide) 7 וגם עורר תגובות CTL חזקות נגד תאים סרטניים ודגמי אתגר נגיפיים בעכברים 9. כאן, באמצעות ICMVs כמערכת חיסון ננו-חלקיקי מודל, אנו מתארים שיטות לאפיון של ננו-ניסוחים חיסון, כולל גודל חלקיקים ומדידות פוטנציאל זטה ומעקב של סחר בחלקיקים לLNs ניקוז (dLNs) ניצול ההדמיה confocal של רקמות cryosectioned 7. בנוסף, אנו מציגים שיטה של ניתוח הרחבת תגובות CTL בעכברים לאחר העברת מאמצת של תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי להביע לוציפראז 9,10 מבוססת הדמיה כל-חיה. לבסוף, אנו דהצביעת tetramer סופר של תאים ההיקפיים mononuclear הדם (PBMCs) לכימות אורך של תגובות תא T אנדוגני בעכברים שחוסנו בחלקיקים 6,9.

ICMVs הוא ניסוח ננו-חלקיקים המבוססים על שומנים מסונתזים על ידי היתוך מבוקר של יפוזומים פשוטים למבני multilamellar, אשר לאחר מכן התייצבו כימי על ידי קבוצות ראש פוספוליפידים cross-linking פונקציונליות maleimide בתוך שכבות שומנים עם dithiol crosslinkers 6. ברגע שICMVs מסונתזים, חלק קטן של חלקיקים יכול לשמש כדי לקבוע את גודל חלקיקים ופוטנציאל זטה (כלומר, תשלום פני השטח של חלקיקים) עם פיזור אור דינמי מערכת (DLS) ומנתח פוטנציאל זטה. DLS אמצעי שינויים בפיזור אור בהשעיות חלקיקים, המאפשרים קביעת מקדם הדיפוזיה והגודל הידרודינמית של חלקיקים 11. השגת גודל חלקיקים עקבי מיצווה לסינתזה אצווה היא קריטיתמאז גודל חלקיקים הוא אחד הגורמים העיקריים המשפיעים על הניקוז לימפטי של חלקיקי חיסון לdLNs וספיגה סלולרית לאחר מכן על ידי נגמ"שים 12,13. בנוסף, ניתן להשיג פוטנציאל זטה על ידי מדידת המהירות של החלקיקים כאשר זרם חשמלי מוחל, המאפשרת קביעת ניידות electrophoretic של חלקיקים וחלקיקי משטח תשלום 11. הבטחת ערכי פוטנציאל זטה עקבית של חלקיקים היא חשובה שכן תשלום של חלקיקי משטח קובע יציבות colloidal, שבה יש השפעה ישירה על פיזור חלקיקים במהלך אחסון ולאחר in vivo ממשל 14,15. על מנת לעקוב אחר חלקיק הלוקליזציה לdLNs, יכול להיות מתויג ICMVs עם fluorophores הרצויה כולל צבעי lipophilic ואנטיגנים קוולנטית מתוייגים. בעקבות חיסון, יכולים להיות מורדמים עכברים בנקודות זמן שונים, dLNs כריתה, cryosectioned, וניתחו עם מיקרוסקופיה confocal. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של דראי הלימפהנינג של שני נשאי חיסון ננו-חלקיקים ואנטיגן לdLNs. בנוסף יכולים להיות מוכתמים סעיפי הרקמות עם נוגדנים שכותרתו fluorescently ומנוצל כדי לקבל מידע נוסף, כגון סוגים של תאים הקשורים לאנטיגן והיווצרות מרכזים נבטי כפי שהראינו בעבר 7.

ברגע שסינתזת החלקיקים היא מותאמת והסחר לdLNs הוא אישר, חשוב לאמת דיבוב של in vivo הרחבת CTL. על מנת לנתח את הדיבוב של תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי בתגובה לחיסון ננו-חלקיקים, שנוצלנו אנטיגן מודל, ovalbumin (OVA), עם OVA 257-264 פפטיד (SIINFEKL) epitope תא CD8 + T immunodominant, המאפשר ניתוח מפורט חיסוני של תגובות תא T אנטיגן הספציפי ל16,17 פיתוח חיסון ראשוני. בפרט, לחקור את הדינמיקה של התרחבות ונדידה של תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי, יש לנו שנוצרומודל עכבר כפול מהונדס על ידי חציית הגחלילית בלוציפראז להביע עכברים הטרנסגניים (לוק) עם עכברים הטרנסגניים OT-לי שיש תאי CD8 + T עם T-cell קולט (TCR) ספציפי לSIINFEKL (בשיתוף עם H-2K ב). מעכברי OT-I / לוק אלה, להביע לוציפראז, יכולים להיות מבודדים תאי OT-אני CD8 + T ומוכנה להעברת מאמצת לעכברי C57BL / 6 נאיביים. ברגע שהזרע, חיסון מוצלח עם חלקיקים המכיל OVA יגרום הרחבת תאי T הועברו, אשר יכול להיות במעקב על ידי ניטור אות פליטת אור עם 9,10 מערכת הדמיה חיה שלמה. טכניקת הדמיה זה לא פולשנית כל הגוף כבר בשימוש עם אנטיגנים נגיפיים או גידול אחרים ב18-20 העבר, חושפת תהליכים מעורבים בהרחבת T תא ברקמות הלימפה והפצה לרקמות היקפית באופן אורך.

משלים לניתוח adoptively תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי הועברו, endogenoתגובות תא T לפרסם חיסון ניתן לבדוק עם מורכב פפטיד-גדול histocompatibility (MHC) assay tetramer 21, שבו מורכב tetramer פפטיד-MHC, מורכב מארבע כיתת MHC-מתויג fluorophore אני מולקולות עמוסות epitopes פפטיד, מועסק כדי לאגד TCR ותווית תאי CD8 + T באופן אנטיגן ספציפי. Assay tetramer פפטיד-MHC יכול להתבצע גם במחקרי נתיחה לאחר מות מסוף לזהות תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי בהלימפה ורקמות היקפית או במחקרים ארוכי טווח עם תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) המתקבלים מהדם סידורי מושך. לאחר מכתים ימפוציטים עם tetramer פפטיד-MHC, cytometry זרימת הניתוח מבוצע ניתוחים מפורטים על הפנוטיפ של תאי-ההרג או כימות של התדר שלהם בין תאי CD8 + T.

Protocol

כל הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת האוניברסיטה על שימוש וטיפול של בעלי חיים (UCUCA) באוניברסיטת מישיגן ומבוצעים על פי המדיניות והנחיות שנקבעה. 1. סינתזה ואפיון של ICMVs Co-עמוס חלבון Antigen וAdjuvant מולקולות <ol style=";text-align:right;dir…

Representative Results

הצעדים מעורבים בסינתזה של ICMVs הם באיור 1 6. בקצרה, סרט שומנים המכילים כל תרופות lipophilic או צבעי ניאון הוא התייבשות בנוכחות תרופות הידרופילי. קטיונים דו ערכיים, כגון Ca 2 +, מתווספים לנהוג היתוך של יפוזומים אניוני לתוך שלפוחית ​​multilamellar. Dithiol crosslinker, כגו?…

Discussion

הפרוטוקול האמור במאמר זה מתאר את הסינתזה ואפיון של מערכת ננו-חלקיקים המבוססים על שומנים חדשה, המכונה ICMVs, ומספק את התהליך של אימות אפקטיבי של ניסוחים חיסון המבוסס על ננו-חלקיקים לגרום לתגובות תא אנטיגן הספציפי CD8 + T. סינתזת ICMV תושלם בכל המצב המימי, וזה יתרון גדול לעומת …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק 1K22AI097291-01 ועל ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי Translational של המכון הלאומי לבריאות בפרס מספר UL1TR000433. אנחנו גם מכירים פרופ 'אירווין דארל ב- MIT ופרופ' מתיאס סטפן בפרד האצ'ינסון מרכז הסרטן על תרומתם בעבודה הראשונית על חלקיקי החיסון ועכברים הטרנסגניים OT-I / לוק.

Materials

1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 mL glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125W/20kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771 (2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765 (2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F., Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. , 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740 (2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105 (2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627 (2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Tags

Nanoparticle VaccineCD8+ T CellWhole-animal ImagingFlow CytometryAntigen-specific T Cell ResponseInterbilayer-crosslinked Multilamellar Vesicles (ICMVs)Bioluminescence ImagingTetramer Staining
check_url/52771?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image