Nanoparticle के टीकाकरण के बाद के विश्लेषण से प्रतिजन विशेष CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया के लिए पूरे पशु इमेजिंग और प्रवाह cytometric तकनीकों
Summary
We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.
Abstract
Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a “pathogen-mimicking” nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.
Introduction
पारंपरिक टीका विकास मुख्य रूप से परीक्षण और त्रुटि के अनुभवजन्य दृष्टिकोण कार्यरत है। हालांकि, biomaterials के और प्रतिरक्षा सक्रियण की आणविक निर्धारकों की खोज की एक विस्तृत सरणी के हाल ही के विकास के साथ, यह तर्क से रोगज़नक़ों 1,2 से निकाली गई जैवभौतिक और जैव रासायनिक संकेतों के साथ टीका योगों डिजाइन करने के लिए अब संभव है। विशेष रूप से, विभिन्न कण दवा वितरण प्लेटफार्मों लिम्फ में रहने गिरावट से टीका घटकों की रक्षा, और कोशिकाओं पेश प्रतिजन के लिए (APCs) उनके सह-डिलीवरी बढ़ाने, वे सबयूनिट एंटीजन और immunostimulatory एजेंटों के साथ सह-लोड किया जा सकता है के रूप में वैक्सीन वाहक के रूप में जांच की गई है नोड्स (LNS), इस प्रकार प्रतिरक्षा उत्तेजना और सक्रियण 3-5 अधिकतम। पहले एक शक्तिशाली वैक्सीन platfor के रूप में प्रदर्शित किया गया है, जो इस रिपोर्ट में, हम एक "रोगज़नक़ नकल उतार" nanoparticle प्रणाली के संश्लेषण का वर्णन करार दिया interbilayer-Crosslinked multilamellar पुटिकाओं (ICMVs),मजबूत साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) और प्रणालीगत और श्लैष्मिक ऊतक डिब्बों 6-9 दोनों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के निकालना के लिए मी। विशेष रूप से, ICMVs साथ टीकाकरण काफी पारंपरिक adjuvants (जैसे, फिटकिरी और Montanide) 7 के साथ टीकाकरण के साथ तुलना में, एक मलेरिया एंटीजन के खिलाफ सीरम आईजीजी का स्तर बढ़ाया और भी ट्यूमर कोशिकाओं और चूहों 9 में वायरल चुनौती मॉडल के खिलाफ प्रबल सीटीएल प्रतिक्रियाएं हासिल हासिल की। इधर, एक मॉडल टीका nanoparticle प्रणाली के रूप में ICMVs का उपयोग करते हुए, हम कण आकार और जीटा संभावित माप और draining LNS के कण की तस्करी की ट्रैकिंग cryosectioned ऊतकों 7 की confocal इमेजिंग के उपयोग (dLNs) सहित टीका नैनो योगों के लक्षण वर्णन के लिए विधियों का वर्णन है। इसके अलावा, हम luciferase व्यक्त प्रतिजन विशेष CD8 + टी कोशिकाओं 9,10 के दत्तक हस्तांतरण के बाद चूहों में सीटीएल प्रतिक्रियाओं के विस्तार का विश्लेषण करने की एक पूरी पशु इमेजिंग आधारित पद्धति प्रस्तुत करते हैं। अंत में, हम डेनैनोकणों 6,9 के साथ टीका लगाया चूहों में अंतर्जात टी सेल प्रतिक्रिया के अनुदैर्ध्य मात्रा का ठहराव के लिए परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) के मुंशी टेट्रामर धुंधला हो जाना।
ICMVs तो रासायनिक dithiol crosslinkers 6 के साथ लिपिड परतों के भीतर पार से जोड़ने maleimide-क्रियाशील फॉस्फोलिपिड सिर समूहों द्वारा स्थिर हो रहे हैं जो multilamellar संरचनाओं में सरल liposomes के नियंत्रित संलयन द्वारा संश्लेषित एक लिपिड आधारित nanoparticle तैयार कर रहे हैं। ICMVs संश्लेषित कर रहे हैं एक बार, नैनोकणों का एक छोटा सा अंश कण आकार और जीटा संभावित एक गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) प्रणाली और एक जीटा संभावित विश्लेषक के साथ (कणों की यानी, सतह प्रभार) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रसार गुणांक के दृढ़ संकल्प और कणों 11 के हाइड्रोडायनामिक आकार की अनुमति के कण निलंबन में प्रकाश बिखरने में डीएलएस उपायों में बदलाव,। बैच संश्लेषण के लिए बैच से लगातार कण आकार को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैकण आकार के बाद से APCs 12,13 से dLNs और बाद में सेलुलर तेज करने के लिए वैक्सीन कणों की लसीका निकासी को प्रभावित प्रमुख कारकों में से एक है। इसके अलावा, जीटा संभावित कणों और कण सतह चार्ज 11 की electrophoretic गतिशीलता के निर्धारण की अनुमति देता है जो एक विद्युत प्रवाह लागू किया जाता है जब कण वेग, को मापने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। कणों की सतह के प्रभारी भंडारण के दौरान और इन विवो प्रशासन 14,15 के बाद कण फैलाव पर सीधा प्रभाव पड़ता है जो कोलाइडयन स्थिरता, निर्धारित करता है के बाद से कणों के अनुरूप जीटा संभावित मूल्यों सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। DLNs के कण स्थानीयकरण को ट्रैक करने के लिए, ICMVs lipophilic रंगों और covalently टैग एंटीजन सहित वांछित fluorophores के साथ लेबल किया जा सकता है। टीकाकरण के बाद, चूहों, dLNs resected, विभिन्न समय बिंदुओं पर euthanized cryosectioned, और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। इस तकनीक को लसीका drai के दृश्य की अनुमति देता हैnanoparticle वैक्सीन वाहक और dLNs को प्रतिजन दोनों की निंग। हम पहले 7 से पता चला है के रूप में ऊतक वर्गों साथ ही इस तरह के प्रतिजन और कीटाणु केन्द्रों के गठन के साथ जुड़े कोशिकाओं के प्रकार के रूप में fluorescently लेबल एंटीबॉडी और अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया, साथ दाग जा सकता है।
कण संश्लेषण अनुकूलित है और dLNs करने की तस्करी की पुष्टि होती है, यह इन विवो सीटीएल विस्तार से निकालना मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है। Nanoparticle के टीकाकरण के जवाब में विशिष्ट प्रतिजन CD8 + टी कोशिकाओं की निकालना का विश्लेषण करने के लिए, हम विस्तृत प्रतिरक्षात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है जो ओवीए 257-264 पेप्टाइड (SIINFEKL) immunodominant CD8 + टी सेल मिलान, साथ, एक मॉडल के प्रतिजन, ovalbumin (ओवीए) का उपयोग किया है प्रारंभिक टीका विकास 16,17 के लिए विशिष्ट प्रतिजन टी सेल प्रतिक्रिया की। विशेष रूप से, विस्तार और प्रतिजन विशेष CD8 + टी कोशिकाओं के प्रवास की गतिशीलता को पूछताछ के लिए, हम उत्पन्न किया है एकटी सेल रिसेप्टर (एच -2 k बी के सहयोग से) SIINFEKL के लिए विशिष्ट (TCR) के साथ CD8 + टी कोशिकाओं के अधिकारी OT-मैं ट्रांसजेनिक चूहों के साथ ट्रांसजेनिक चूहों (ल्यूक) luciferase व्यक्त जुगनू पार करके डबल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल। इन OT-मैं / ल्यूक चूहों से, luciferase व्यक्त, ओटी-मैं CD8 + टी कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है और भोले C57BL / 6 चूहों में दत्तक हस्तांतरण के लिए तैयार किया। वरीयता प्राप्त एक बार, ओवीए युक्त नैनोकणों के साथ सफल प्रतिरक्षण एक पूरी पशु इमेजिंग प्रणाली 9,10 साथ bioluminescence संकेत निगरानी से लगाया जा सकता है जो हस्तांतरित टी कोशिकाओं, के विस्तार में परिणाम होगा। इस गैर इनवेसिव पूरे शरीर इमेजिंग तकनीक के लिए एक अनुदैर्ध्य तरीके से परिधीय ऊतकों को टी सेल ल्य्म्फोइड ऊतकों में विस्तार और प्रसार में शामिल प्रक्रियाओं का खुलासा, पिछले 18-20 में अन्य वायरल या ट्यूमर एंटीजन के साथ इस्तेमाल किया गया है।
Adoptively हस्तांतरित प्रतिजन विशेष CD8 + टी कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए पूरक, endogenoहमें टी सेल प्रतिक्रिया में कार्यरत है, टीकाकरण चार फ्लोरोफोरे टैग MHC-वर्ग मैं अणुओं से मिलकर एक पेप्टाइड MHC टेट्रामर जटिल, पेप्टाइड epitopes के साथ भरी हुई जिसमें पेप्टाइड प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (MHC) टेट्रामर परख 21, के साथ जांच की जा सकती पोस्ट एक विशिष्ट प्रतिजन ढंग से TCR और लेबल CD8 + टी कोशिकाओं को बाध्य करने के लिए। पेप्टाइड MHC टेट्रामर परख ल्य्म्फोइड और परिधि के ऊतकों में विशिष्ट प्रतिजन CD8 + टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए टर्मिनल शव-परीक्षा पढ़ाई में या धारावाहिक रक्त ड्रॉ से प्राप्त परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) के साथ अनुदैर्ध्य अध्ययन में या तो किया जा सकता है। पेप्टाइड MHC टेट्रामर साथ लिम्फोसाइटों धुंधला के बाद, प्रवाह cytometry विश्लेषण CD8 + टी कोशिकाओं के बीच उनकी आवृत्ति की CTLs के phenotype या मात्रा का ठहराव पर विस्तृत विश्लेषण के लिए किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में प्रदान प्रोटोकॉल ICMVs करार दिया संश्लेषण और एक नया लिपिड आधारित nanoparticle प्रणाली के लक्षण, का वर्णन है, और विशिष्ट प्रतिजन CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए nanoparticle आधारित टीका योगों के प्रभा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान 1K22AI097291-01 अनुदान द्वारा समर्थित और पुरस्कार नंबर UL1TR000433 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के translational विज्ञान आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा किया गया था। हम यह भी टीका नैनोकणों और ओटी-मैं / ल्यूक ट्रांसजेनिक चूहों पर प्रारंभिक काम पर उनके योगदान के लिए फ्रेड हचिंसन कैंसर सेंटर में एमआईटी और प्रो मथायस स्टीफ़न पर प्रो डेरेल इरविन को स्वीकार करते हैं।
Materials
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 mL glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125W/20kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo |
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