Histological विश्लेषण के लिए पेशी cryosections की तैयारी में है और don'ts
Summary
Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.
Abstract
पेशी बायोप्सी के histological मूल्यांकन न्यूरोमस्कुलर विकारों की विकृति के विकास और प्रगति की समझ में एक अनिवार्य उपकरण के रूप में कार्य किया है। हालांकि, ऐसा करने के क्रम में, उचित देखभाल excising और इष्टतम धुंधला प्राप्त करने के ऊतकों के संरक्षण जब उठाए जाने की जरूरत है। ऊतक के संरक्षण की एक विधि पैराफिन मोम के साथ उन्हें embedding तो फॉर्मेल्डीहाइड में ऊतकों फिक्सिंग और शामिल है। इस विधि को अच्छी तरह से आकृति विज्ञान को बरकरार रखता है और आरटी पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए अनुमति देता है, लेकिन बोझिल है और जहरीले रसायनों के निपटने की आवश्यकता है। इसके अलावा, प्रभावी immunostaining के लिए प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल जरूरी है जो प्रतिजन पार से जोड़ने, में formaldehyde निर्धारण का परिणाम है। इसके विपरीत, जमे हुए सेक्शनिंग निर्धारण की आवश्यकता होती है और इस तरह जैविक प्रतिजन रचना को बरकरार रखे हुए नहीं है। इस विधि को भी intraopera की तरह जल्दी ऊतकीय मूल्यांकन की आवश्यकता होगी, स्थितियों में यह विशेष रूप से उपयोगी है, जिससे समय के आसपास जल्दी बारी में एक विशिष्ट लाभ प्रदान करता हैशल्य चिकित्सा बायोप्सी ेश्य। यहाँ हम अलग histological और प्रतिरक्षात्मक धब्बे के साथ दृश्य के लिए पेशी बायोप्सी की तैयारी करने का सबसे प्रभावी विधि का वर्णन।
Introduction
मांसपेशी ऊतक विज्ञान की परीक्षा न्यूरोमस्कुलर विकारों 1-4 की विभिन्न प्रकार की समझ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अन्य तकनीकों के साथ संयुक्त, यह शोधकर्ताओं विकृति की अभिव्यक्ति और प्रगति की एक बेहतर विचार प्राप्त करने के लिए और यह भी एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप 5-10 की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हो सकता है की अनुमति देता है। छांटना से पहले तुरंत शारीरिक स्थिति को संरक्षित करने के लिए इतनी के रूप में हालांकि, सटीक होना, ऊतकों उचित तरीके से संरक्षित किया जाना चाहिए। यह हटाने, संरक्षण, सेक्शनिंग, और धुंधला दौरान बड़ी सावधानी की आवश्यकता है।
टिश्यूज प्रकाश सूक्ष्म अध्ययन के लिए दो अलग अलग तरीकों से तैयार किया जा सकता। (FFPE) वर्गों, एम्बेडेड पहली विधि, formalin तय आयल ऊतकों पैराफिन मोम 11,12 के साथ एम्बेडेड किए जाने से पहले 10% प्राकृतिक बफर फॉर्मेल्डीहाइड में तय किए जाने की आवश्यकता है। नियतन कदम है लेकिन यह भी पार लिंक अंतर्जात जनसंपर्क बेहतर आकारिकी की रक्षा करने में मदद करता हैoteins इस प्रकार immunostaining के लिए जटिल प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रक्रियाओं की जरूरत महसूस और ऐसे वर्गों पर 12 एंजाइमी धुंधला की संभावना को नष्ट करने। जमे हुए वर्गों, दूसरी ओर, पूर्व निर्धारित या संसाधित करने की आवश्यकता नहीं है; इसलिए, प्रोटीन देशी जैविक रचना 13,14 बनाए रखने में सक्षम हैं। इसके अलावा, जमे हुए वर्गों को भी समय पर सार्कोमा और अन्य शल्य चिकित्सा बायोप्सी 15 के intraoperative निदान में उदाहरण के लिए आवश्यक है, जो त्वरित प्रतिक्रिया समय, के लिए अनुमति देते हैं। ठीक से नहीं किया है, हालांकि, इस विधि histological परीक्षा के लिए वर्गों अयोग्य बना पेशी वास्तुकला में परिवर्तन का परिचय जो क्षति, फ्रीज होने का खतरा है। इस पत्र में उचित जांच के लिए इष्टतम धुंधला को प्राप्त करने के क्रम में पेशी बायोप्सी तैयार करने के लिए सबसे प्रभावी तरीका की रूपरेखा तैयार करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल और immunohistochemistry के विभिन्न न्यूरोमस्कुलर विकारों में अभिव्यक्ति और विकृति विज्ञान की प्रगति को समझने में महत्वपूर्ण औजार के रूप में इस्तेमाल किया गया है। माइल्ड, मांसपेशियों में बायोप्सी पहले…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).
Materials
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029 |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
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