И что нельзя делать в подготовке мышц криосрезы для гистологического анализа

Summary

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Abstract

Гистологическая оценка мышечных биопсий служил в качестве незаменимого инструмента в понимании развития и прогрессирования патологии нервно-мышечных расстройств. Тем не менее, для того, чтобы сделать это, правильный уход должны быть приняты, когда иссечение и сохранение тканей для достижения оптимального окрашивания. Один из способов сохранения тканей включает фиксации тканей в формальдегид, а затем встраивания их парафином. Этот метод сохраняет морфологию также и позволяет длительное хранение при комнатной температуре, но громоздка и требует обработки токсичными химикатами. Кроме того, результаты формальдегида фиксации в антигена сшивки, что требует протоколы антиген извлечения для эффективного иммунного окрашивания. Напротив, замороженные секционирование не требует фиксации и, таким образом, сохраняет биологическую конформацию антигена. Этот метод также обеспечивает явное преимущество в быстрой свою очередь вокруг времени, что делает его особенно полезным в ситуациях, требующих быстрого гистологическая оценка как intraoperaного хирургических биопсий. Здесь мы опишем наиболее эффективный способ получения мышечной биопсии для визуализации с различными гистологическими и иммунологическими пятен.

Introduction

Экспертиза мышечной гистологии играет важную роль в понимании различных типов нервно-мышечных расстройств ^1-4. В сочетании с другими методами, что позволяет исследователям получить лучшее представление о проявлении и прогрессирования патологии, а также может иметь важное значение для оценки эффективности терапевтического вмешательства ^5-10. Однако, чтобы быть точным, ткани должны быть сохранены в надлежащем порядке, с тем чтобы сохранить физиологическое состояние непосредственно перед удалением. Это требует большой осторожности во время удаления, сохранения, секционирования и окрашивания.

Ткани могут быть получены двумя различными способами для легкой микроскопическом исследовании. Первый способ, фиксированных формалином парафин (FFPE) секции, требуется ткани, чтобы быть фиксировали в 10% буферном растворе формальдегида природного прежде чем с встроенной парафина ^11,12. Шаг фиксация помогает сохранить морфологию лучше, но также перекрестные ссылки эндогенного прoteins что требует сложная антиген извлечения процедуры иммунным и исключая возможность окрашивания ферментативной на таких участках ^12. Замороженные срезы, с другой стороны, не должны быть предварительно обработаны или фиксированной; Поэтому, белки способны удерживать родные биологические конформации ^13,14. Кроме того, замороженные срезы также позволяют быстро времени оборота, что в некоторых случаях необходимо, например, в интраоперационной диагностике сарком и других хирургических биопсий ^15. Тем не менее, если не сделано должным образом, этот метод склонен к заморозить ущерб, который вносит изменения в мышечной архитектуре, делая секции непригодным для гистологического исследования. Эта статья будет выделить наиболее эффективный способ получения мышечной биопсии для того, чтобы достичь оптимального окрашивания для тщательного осмотра.

Protocol

1. Ткань Урожай и замораживание мышечных тканей Эвтаназии мышь с передозировкой изофлуран (2-хлор-2- (дифторметокси) -1,1,1-трифтор-этан). Выполните этот шаг в вытяжном шкафу и использовать дополнительный метод сдерживания, такие как эксикаторе или колпаком, содержащей ватным тампоно?…

Representative Results

Установка для сбора и замораживания тканей можно увидеть на рисунке 1. Вырезанные ткани должны храниться на марлю, пропитанную PBS, чтобы избежать высыхания (рис 1А). Когда ткани выбирают так, чтобы быть использованы для гистологического анализа они должны быть погружен…

Discussion

Гистологии и иммуногистохимии были использованы в качестве основных инструментов в понимании проявление и прогрессирование патологии в различных нервно-мышечных нарушений. Классически, мышечные биопсии были впервые зафиксированы в формальдегид, а затем с встроенной парафина. В то в…

Materials

Cryostat	Leica CM 1850	Leica Microsystems Inc.	Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific
Microscope	Nikon Eclipse 50i	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus
Image analysis software	Nikon Imaging Software Basic Research	Nikon Instruments Inc.	1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph
Isoflurane	14043-220-05	JD Medical Dist. Co., Inc.	JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029
OCT	4583	Sakura Inc.	Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem
Freeze It	23-022524	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Disposable tissue mold	22-363-554	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Colorfrost plus slides	9991001	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Acetone	650501-4L	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific
Ethyl alcohol	HC-1300-1GL	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
2-methyl butane	M 32631-SL	Sigma-Aldrich	3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific
Xylene	HC-7001GA	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Cytoseal 280	8311-4	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific
Hematoxylin Gill #3	CS402-1D	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific
Eosin	6766007	Thermofisher	790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific