胸腺表征祖定居在小鼠胚胎使用<em>在体内</em>和<em>在体外</em>测定
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
表征胸腺解决祖重要的是要了解T细胞发育的前期阶段，胸腺，必须设计一种T细胞置换淋巴细胞减少患者的策略。我们研究了胸腺从13鼠胚胎日和18 thymi沉降祖细胞由两个体外互补和体内技术，无论是基于“悬滴”的方法。这种方法允许辐照的殖民胸腺胎儿与叶和E13 / E18还是通过CD45异型标记，从而跟随他们的后代区分胸腺祖。定植混合种群允许分析的祖细胞生物学特性细胞自主的分歧，而与殖民人口要么尽可能去除选择性的竞争压力。殖民胸腺瓣也可以在免疫缺陷雄性受体小鼠允许成熟T细胞后代的体内分析，如叔种群动态接枝他外周免疫系统和不同的组织和器官的殖民化。胎儿胸腺器官培养透露，E13祖细胞迅速发展成为成熟的全部CD3 +细胞，引起了规范γδT细胞亚群，被称为树突状上皮性T细胞。相比之下，E18祖细胞有延迟分化和无法生成树突上皮T细胞。 / – –胸腺-接枝的CD3外周血监测小鼠进一步表明，E18胸腺沉降祖生成，随着时间的推移，更大的成熟T细胞比它们的E13对应的号码，无法在短期内胎儿胸腺可以理解的特征器官培养。
Introduction
T淋巴细胞，轴承αβ或γδT细胞受体（TCR），区分在一个专门的机构，胸腺。充分发展胸腺分为两个不同的区域：皮质，其中胸腺祖发展和地点的胸腺细胞重新排列高效TCR的β和α链基因是从程序性死亡（被称为阳性选择的过程）获救;和髓质，在这里选择的胸腺细胞与太强的反应，以自配体被删除（负选择）1,2。胸腺来源于第三咽囊以为稍后由间充质细胞3包围的内胚层层。它是由起始于天胚胎E12，此后，连续招募所需的正常T细胞发育4造血祖细胞定植。胸腺移民通过连续的发育阶段发展，通过严格监管的程序，发起并策划迈ntained由胸腺Notch信号传导途径的相互作用时的活化与其配体，δ-样4，表达于胸腺上皮细胞（TECs的）5。
胸腺细胞发育开始于所谓的CD4 – CD8 –双阴性（DN）的阶段。 ，DN2（CD25 + CD44 +），DN3（CD25 + CD44 – ）和DN4（CD25 – CD44 – ） – DN胸腺细胞可以根据CD25和CD44的表达到DN1（CD44 + CD25）进一步细分。 CD24（HSA）和CD117（的c-Kit）进一步细分DN1隔成5个亚群，其中DN1a和b对应于早期胸腺祖细胞（ETP）。胸腺细胞重新排列T细胞受体δ，β和α链在DN阶段，并进行预-TCR选择（DN3，DN4阶段）。他们进一步迁移到的CD4 + CD8 +双阳性（DP）室，其中的TcRα链重新排列之前正和负塞莱ction。在这个阶段，大多数胸腺细胞被消除，只有一小部分（3-5％）达到的CD4 +或CD8 +成熟T细胞室。
淋巴分化途径过程通过造血干细胞的生成多潜能祖细胞（MPP）和淋巴引发的多潜能祖细胞（LMPP）失去的红细胞和巨核细胞潜力6阶段。 LMPP由缺乏分化血细胞标记物表型定义（谱系阴性，林– ），的c-Kit（CD117）的表达，的Sca-1和Flt3的/ FLK2（CD135）和没有白细胞介素的可检测水平的（ IL）-7受体α链（IL-7rα或CD127）。 LMPPs进一步分化为普通淋巴祖（CLP）7，到这个阶段已经失去了产生骨髓细胞的能力。电保留淋巴细胞（B和T细胞），NK细胞，DC和先天淋巴样细胞（ILC）的潜力，并从LMPP相差CD1的表达27，以及缺乏高水平的Sca-1的。
虽然胸腺解决祖细胞（TSP）的性质已经被广泛讨论8，它成为近日明确表示，TSP变化表型，分化潜能和功能，整个开发9。我们的体外和体内测定进行到TSP，通过FACS分离细胞从任E13（第一波）或E18（第二波）排序表征。胎儿胸腺器官培养（FTOC）与E13的E18和祖人数相等，不同的轴承异型标志殖民，使跟随他们类似的发展环境和子代细胞揭示内在特性，这两种类型的祖细胞之间的不同照射胸腺叶。无论是通过E13 E18或定植TSP胸腺叶允许开发无选择，由于双方的祖细胞之间的竞争。 在体内移植的殖民胸腺裂片进一步表明还牛逼他E13的成熟后代和E18 TSP 在体内生物不同的特性。从第一波的TSP快速生成T细胞，但引起低的数字αβγδ和T细胞。在后者我们检测Vγ5Vδ1树突上皮T细胞（DETC）中，具有一个不变的TcR，迁移到它们施加在伤口愈合的函数和胚胎发育10中仅产生的表皮。与此相反，TSP从第二波需要更长的时间，以产生高数量的TcR + T细胞和不能生成DETC。
Protocol
Representative Results
Discussion
两个主要的测定法可用于分析T细胞分化的体外 。最近报道是造血祖细胞与骨髓基质细胞，OP9的共培养，表达Noth1的配位体，δ-样1或4 12，这2-D测定是容易执行的，高效的和灵敏的，允许分析在单个细胞水平。然而，它既不支持T细胞发育超出DP的阶段也没有γδDETC 13的产生，这两者需要与胸腺上皮的直接相互作用。
FTOCs长期以来一直用于分析T细胞发育<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
巴斯德研究所，INSERM，法新社国立德RECHERCHE ANR（格兰特的淋巴细胞'），兴中未来投资计划和“香格里拉法甲勒驳癌症”的支持。
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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