Encapsulation termogênico pré-adipócitos para transplante em adiposo Depots Tissue

Summary

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Abstract

Encapsulamento celular foi desenvolvido para reter células viáveis ​​dentro das membranas semi-permeáveis. As células encapsuladas podem trocar enxertados metabolitos de baixo peso molecular em tecidos do hospedeiro a ser tratado para conseguir a sobrevivência a longo prazo. A membrana semipermeável permite enxertados células encapsuladas para evitar a rejeição pelo sistema imunológico. O processo de encapsulação foi concebido para permitir uma libertação controlada de compostos bioactivos, tais como insulina, hormonas, e outras citoquinas. Descrevemos aqui um método para a encapsulação de células catabólicos, que consomem lípidos para a produção de calor e dissipação de energia (termogénese) no tecido adiposo intra-abdominal de ratos obesos. A encapsulação de células catabólicos termogénicos podem ser potencialmente aplicáveis ​​para a prevenção e tratamento da obesidade e diabetes do tipo 2. Uma outra aplicação potencial das células catabólicos pode incluir a desintoxicação de álcoois ou outros metabolitos tóxicos e poluentes ambientais.

Introduction

Aumento da incidência de doenças crônicas ^um tem estimulado estudos sobre o transplante de populações de células terapêuticas ^2. Ou células-tronco alogénicas, isogénicas são os tipos de células mais comumente utilizados para estas aplicações ^2. No entanto, estes tratamentos não permitem o controlo de diferenciação e migração de células estaminais, após o implante e não são economicamente eficiente. Transplante de células geneticamente modificadas com funções benéficas antecipa melhorar o tratamento de muitas doenças. No entanto, as modificações genéticas de células são reconhecidas pelo sistema imunológico do hospedeiro, por isso, estes tratamentos requerem imunossupressão ^3. A encapsulação de células produtoras de insulina tem sido desenvolvido pelo Dr. Chang ^4. A técnica baseia-se na encapsulação de células em gotículas de alginato que são imersos numa solução de cloreto de cálcio. Moléculas de alginato composto por ácido manurónico (M) e ácido gulurónico (G) e pode ser ligado por Ca ²⁺. Após a gelificação, as esferas são suspensas numa solução de poli-L-lisina (PLL). Durante este passo, PLL se liga a G e H nas moléculas de alginato que estabelece membrana da cápsula. A porosidade da membrana da cápsula pode ser modulada por variação das concentrações de H e de PLL, o tempo de incubação e temperatura. A ligação de PLL também depende do tipo e concentração do alginato. Matrizes de alginato reticulados com iões Ca2 ^+, são instáveis ​​no ambiente fisiológico ou em soluções tampão comuns com elevada concentração de fosfato e iões citrato. Estes tampões podem extrair de Ca2 ⁺ a partir do alginato e liquefazer o núcleo. A liquefacção do núcleo alginato fornece espaço no interior das cápsulas para movimento celular e crescimento. As células encapsuladas em alginato polianiónico com policatiónico poli-L-lisina (APL) são impermeáveis ​​para as imunoglobulinas mas têm influxo de nutrientes e de efluxo de toxinas. Estas propriedades da APL permitir a longo prazo survival de células encapsuladas após o transplante em geneticamente diferentes hosts. Elliott et ai. Relataram a sobrevivência de funcionamento das células pancreáticas porcinas encapsulados num paciente humano nove anos após o implante ^5.

Técnicas de encapsulação podem ser classificados em microencapsulação (3-800 pM) e macroencapsulação (maiores do que 1000 mm). As microcápsulas são mais duráveis ​​que macrocápsulas ^6. Desde a sua descoberta pelo Dr. Chang e colegas em 1964, a microencapsulação tem sido amplamente utilizada para a encapsulação de células produtoras de insulina anabolizantes, hormonas, e outras moléculas bioactivas ^7. Estes tratamentos enfrentou vários desafios no tecido hospedeiro, incluindo fibrose e resposta imune ^8. Inicialmente, os efeitos secundários relacionados com a qualidade de biopolímeros foram resolvidos. No entanto, o transplante de células anabólicos ainda inicia efeitos colaterais, tais como fibrose, como um resultado da hormona overprodução fora de uma glândula especializado.

Nas últimas décadas, a obesidade e diabetes tipo 2 tem alcançado proporções epidêmicas ^9. Mais de 30% das pessoas adultas em todo o mundo estão acima do peso e obesos ^10. (IAB) a formação de gordura aumento da pressão intra-abdominal aumenta a incidência de inflamação crônica e promove diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares, certos tipos de câncer, e outras morbidades ^11-13. Várias linhas de evidência sugeriram que a patogénese associada com gordura Iab pode ser evitada por adipócitos específicos. Estudos recentes demonstraram que o transplante de adipócitos subcutâneos na região Iab pode melhorar o metabolismo e diminuir a obesidade e resistência à insulina em roedores in vivo ^14. Redução efectiva da obesidade e resistência à insulina está associada com adipócitos termogénicos, capazes de dissipar a energia na forma de calor ^15,16. Termogênico modificação dos adipócitos pode ser conseguida por transfecção estávelde genes que participam no desacoplamento mitocondrial de protões, tais como proteína desacopladora 1 (UCP1) ou de genes que regulam a expressão de UCP1 e outros genes termogênicos ^15,16. Os nossos estudos recentes mostraram que a deficiência em aldeído desidrogenase 1 a1 (Aldh1a1) leva à remodelação de gordura termogénico Iab que reduz a obesidade e resistência à insulina nestes ratos ^17,18. Notavelmente, o encapsulamento de termogénico Aldh1a1 deficiente (Aldh1a1 – / – pré-adipócitos) medeia mesmo efeito terapêutico em gordura Iab em ratos obesos do tipo selvagem, sugerindo novas oportunidades terapêuticas para o tratamento de gordura Iab ^18. Em situações experimentais, células encapsuladas permitir aos investigadores estudar efeitos das populações de células específicas em uma forma rentável ^19. Aqui nós discutimos o método de encapsulação de uma linha celular catabólico termogénico e seu laboratório e aplicação terapêutica num modelo de rato de obesidade. O protocolo descreve três fases para a produção de microcápsula (Figura 1): a formação das microesferas de alginato (Figura 1a), a formação do policatiónico poli-L-lisina (PLL) membranas na superfície de microesferas (Figura 1B), e a remoção do núcleos de alginato (Figura 1C).

Protocol

O protocolo do estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética da Universidade do Estado de Ohio. As experiências com animais foram aprovados pelo protocolo do IACUC. Todos os procedimentos foram realizados sob o nível 2 de biossegurança armário com fluxo laminar. Nós seguimos todos os requisitos e procedimentos de segurança padrão. A técnica de microencapsulação para a preparação de microcápsulas foi realizada tal como descrito 17, 18. 1. Preparações de Materiais <o…

Representative Results

A Figura 1 mostra que todos os passos da produção de microesferas pode ser controlada ao microscópio. A Figura 2A mostra como a co-cultura de adipócitos com uma monocamada de células encapsuladas. A Figura 2B é um exemplo representativo de um estudo quantitativo utilizando adipócitos / microcápsulas co-culturas que foram descritas na secção 5. Os lisados ​​de adipócitos foram analisadas utilizando a técnica Western Blot. Células encapsuladas não foram …

Discussion

Vários métodos têm sido usados ​​para encapsular células, incluindo a secagem, extrusão, e emulsão ^19. Neste método, as drageias de alginato são extrudidas através de uma agulha, em seguida, revestidas com PLL e o núcleo de alginato será dissolvido para completar o encapsulamento. Embora este método tenha sido utilizado durante anos, a formação dos grânulos com o tamanho desejado e a forma esférica é ainda difícil. O tamanho das cápsulas é altamente dependente da viscosidade da soluç?…

Materials

Encapsulation device (VAR V1)	Nisco	LIN-0042	None
KD scientific syringe pump	KD scientific	780100Y	None
Olympus microscope	Olympus Optical	IX70-S8F2	None
Sodium alginate	Sigma	MKBP8122V	None
Poly-l-lysine hydrobromide (PLL)	Sigma	020M5006V	None
Calcium chloride	Sigma	SLBJ2662V	None
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma	030M0200	None
Sodium chloride	Sigma	SLBD2595V	None
Mini-PROTEAN TGX Gels	Bio-Rad	456-1093	None
ATGL primary antibody (from rabbit)	Cell Signaling	2138S	None
Secondary anti body (anti rabbit)	LI-COR	926-68071	None
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer	Boston BioProducts	D25Y6Z	None
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	RNBD2893	None
Trypsin	Gibco	25200-056	None
Cortizone 10 anti-itch ointment	Cortizone 10	C4029138	None
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	None
Newborn calf serum (CS)	Sigma	N4762	None
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F4135	None
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I0516	None
Dexamethasone	Sigma	D4902	None
Insulin (bovine)	Sigma	I5879	None
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	4693159001	None