Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.
Encapsulamento celular foi desenvolvido para reter células viáveis dentro das membranas semi-permeáveis. As células encapsuladas podem trocar enxertados metabolitos de baixo peso molecular em tecidos do hospedeiro a ser tratado para conseguir a sobrevivência a longo prazo. A membrana semipermeável permite enxertados células encapsuladas para evitar a rejeição pelo sistema imunológico. O processo de encapsulação foi concebido para permitir uma libertação controlada de compostos bioactivos, tais como insulina, hormonas, e outras citoquinas. Descrevemos aqui um método para a encapsulação de células catabólicos, que consomem lípidos para a produção de calor e dissipação de energia (termogénese) no tecido adiposo intra-abdominal de ratos obesos. A encapsulação de células catabólicos termogénicos podem ser potencialmente aplicáveis para a prevenção e tratamento da obesidade e diabetes do tipo 2. Uma outra aplicação potencial das células catabólicos pode incluir a desintoxicação de álcoois ou outros metabolitos tóxicos e poluentes ambientais.
Aumento da incidência de doenças crônicas um tem estimulado estudos sobre o transplante de populações de células terapêuticas 2. Ou células-tronco alogénicas, isogénicas são os tipos de células mais comumente utilizados para estas aplicações 2. No entanto, estes tratamentos não permitem o controlo de diferenciação e migração de células estaminais, após o implante e não são economicamente eficiente. Transplante de células geneticamente modificadas com funções benéficas antecipa melhorar o tratamento de muitas doenças. No entanto, as modificações genéticas de células são reconhecidas pelo sistema imunológico do hospedeiro, por isso, estes tratamentos requerem imunossupressão 3. A encapsulação de células produtoras de insulina tem sido desenvolvido pelo Dr. Chang 4. A técnica baseia-se na encapsulação de células em gotículas de alginato que são imersos numa solução de cloreto de cálcio. Moléculas de alginato composto por ácido manurónico (M) e ácido gulurónico (G) e pode ser ligado por Ca 2+. Após a gelificação, as esferas são suspensas numa solução de poli-L-lisina (PLL). Durante este passo, PLL se liga a G e H nas moléculas de alginato que estabelece membrana da cápsula. A porosidade da membrana da cápsula pode ser modulada por variação das concentrações de H e de PLL, o tempo de incubação e temperatura. A ligação de PLL também depende do tipo e concentração do alginato. Matrizes de alginato reticulados com iões Ca2 +, são instáveis no ambiente fisiológico ou em soluções tampão comuns com elevada concentração de fosfato e iões citrato. Estes tampões podem extrair de Ca2 + a partir do alginato e liquefazer o núcleo. A liquefacção do núcleo alginato fornece espaço no interior das cápsulas para movimento celular e crescimento. As células encapsuladas em alginato polianiónico com policatiónico poli-L-lisina (APL) são impermeáveis para as imunoglobulinas mas têm influxo de nutrientes e de efluxo de toxinas. Estas propriedades da APL permitir a longo prazo survival de células encapsuladas após o transplante em geneticamente diferentes hosts. Elliott et ai. Relataram a sobrevivência de funcionamento das células pancreáticas porcinas encapsulados num paciente humano nove anos após o implante 5.
Técnicas de encapsulação podem ser classificados em microencapsulação (3-800 pM) e macroencapsulação (maiores do que 1000 mm). As microcápsulas são mais duráveis que macrocápsulas 6. Desde a sua descoberta pelo Dr. Chang e colegas em 1964, a microencapsulação tem sido amplamente utilizada para a encapsulação de células produtoras de insulina anabolizantes, hormonas, e outras moléculas bioactivas 7. Estes tratamentos enfrentou vários desafios no tecido hospedeiro, incluindo fibrose e resposta imune 8. Inicialmente, os efeitos secundários relacionados com a qualidade de biopolímeros foram resolvidos. No entanto, o transplante de células anabólicos ainda inicia efeitos colaterais, tais como fibrose, como um resultado da hormona overprodução fora de uma glândula especializado.
Nas últimas décadas, a obesidade e diabetes tipo 2 tem alcançado proporções epidêmicas 9. Mais de 30% das pessoas adultas em todo o mundo estão acima do peso e obesos 10. (IAB) a formação de gordura aumento da pressão intra-abdominal aumenta a incidência de inflamação crônica e promove diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares, certos tipos de câncer, e outras morbidades 11-13. Várias linhas de evidência sugeriram que a patogénese associada com gordura Iab pode ser evitada por adipócitos específicos. Estudos recentes demonstraram que o transplante de adipócitos subcutâneos na região Iab pode melhorar o metabolismo e diminuir a obesidade e resistência à insulina em roedores in vivo 14. Redução efectiva da obesidade e resistência à insulina está associada com adipócitos termogénicos, capazes de dissipar a energia na forma de calor 15,16. Termogênico modificação dos adipócitos pode ser conseguida por transfecção estávelde genes que participam no desacoplamento mitocondrial de protões, tais como proteína desacopladora 1 (UCP1) ou de genes que regulam a expressão de UCP1 e outros genes termogênicos 15,16. Os nossos estudos recentes mostraram que a deficiência em aldeído desidrogenase 1 a1 (Aldh1a1) leva à remodelação de gordura termogénico Iab que reduz a obesidade e resistência à insulina nestes ratos 17,18. Notavelmente, o encapsulamento de termogénico Aldh1a1 deficiente (Aldh1a1 – / – pré-adipócitos) medeia mesmo efeito terapêutico em gordura Iab em ratos obesos do tipo selvagem, sugerindo novas oportunidades terapêuticas para o tratamento de gordura Iab 18. Em situações experimentais, células encapsuladas permitir aos investigadores estudar efeitos das populações de células específicas em uma forma rentável 19. Aqui nós discutimos o método de encapsulação de uma linha celular catabólico termogénico e seu laboratório e aplicação terapêutica num modelo de rato de obesidade. O protocolo descreve três fases para a produção de microcápsula (Figura 1): a formação das microesferas de alginato (Figura 1a), a formação do policatiónico poli-L-lisina (PLL) membranas na superfície de microesferas (Figura 1B), e a remoção do núcleos de alginato (Figura 1C).
Vários métodos têm sido usados para encapsular células, incluindo a secagem, extrusão, e emulsão 19. Neste método, as drageias de alginato são extrudidas através de uma agulha, em seguida, revestidas com PLL e o núcleo de alginato será dissolvido para completar o encapsulamento. Embora este método tenha sido utilizado durante anos, a formação dos grânulos com o tamanho desejado e a forma esférica é ainda difícil. O tamanho das cápsulas é altamente dependente da viscosidade da soluç?…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Jennifer Petrosino e David DiSilvestro para a ajuda editorial. Esta pesquisa foi apoiada pelo Prêmio Número 20020728 da American Egg Board e Prêmio Número 10040042 da Novo Nordisk Farmacêutica, bem como pelo Centro de Inovação Alimentar, Instituto de Assuntos Internacionais, Centro de Pesquisa Avançada Functional Foods, e Empreendedorismo na OSU, bem como a National Science Foundation conceder CEE-0914790 (LJL). O projeto descrito foi apoiado pelo Prêmio Número R21OD017244 (OZ) e UL1RR025755 (OSUCCC) a partir do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, financiado pelo Escritório do Diretor, National Institutes of Health (OD) e apoiado pelo NIH Roteiro para a Investigação Médica e NCI P30CA16058. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos ou o National Institutes of Health.
Encapsulation device (VAR V1) | Nisco | LIN-0042 | None |
KD scientific syringe pump | KD scientific | 780100Y | None |
Olympus microscope | Olympus Optical | IX70-S8F2 | None |
Sodium alginate | Sigma | MKBP8122V | None |
Poly-l-lysine hydrobromide (PLL) | Sigma | 020M5006V | None |
Calcium chloride | Sigma | SLBJ2662V | None |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 030M0200 | None |
Sodium chloride | Sigma | SLBD2595V | None |
Mini-PROTEAN TGX Gels | Bio-Rad | 456-1093 | None |
ATGL primary antibody (from rabbit) | Cell Signaling | 2138S | None |
Secondary anti body (anti rabbit) | LI-COR | 926-68071 | None |
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer | Boston BioProducts | D25Y6Z | None |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | RNBD2893 | None |
Trypsin | Gibco | 25200-056 | None |
Cortizone 10 anti-itch ointment | Cortizone 10 | C4029138 | None |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | None |
Newborn calf serum (CS) | Sigma | N4762 | None |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | None |
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I0516 | None |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | None |
Insulin (bovine) | Sigma | I5879 | None |
Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693159001 | None |