الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B
Summary
Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.
Abstract
Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.
Introduction
الهدف من هذه المقالة لوصف بالتفصيل منهجية لتوليد وتوصيف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مفتش الإنسان التي تم الحصول عليها من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية الإنسان (PBMCs).
نما الاهتمام لدراسة الأجسام المضادة البشرية في كثير من المجالات المختلفة للبحث. على وجه الخصوص، العديد من المجموعات البحثية المهتمة في علم الأمراض الناجمة عن أضداد ذاتية 1-3. لقد المستنسخة وتتميز المسببة للأمراض أضداد ذاتية 1. دراسة أضداد ذاتية يمكن أن تساعد على تحديد أهدافها ووضع استراتيجيات علاجية، على سبيل المثال، وذلك باستخدام الأجسام المضادة منافس 4. وعلاوة على ذلك، ودراسة الأجسام المضادة البشرية يمكن أيضا أن تكون ذات فائدة في مجالات أخرى من مجالات البحوث، أي لتقييم الاستجابة المناعية بعد التطعيم 5، لتوصيف الشخصي الأجسام المضادة للأفراد التي تعرضت وأصبحت مقاومة لمسببات الأمراض المحددة 6 أو للدراسة التي الأجسام المضادة هي فيمرجع الطبيعي 7،12.
وقد تم تطوير العديد من التقنيات لتوليد المؤتلف الاجسام المضادة الإنسان 12/08؛ معظم هذه استخدام عرض فج وتخليد B-الخلية. استخدام عرض فج تم تطبيق على نطاق واسع لاكتشاف الأجسام المضادة الجديدة 13. ومع ذلك فإنه لديه العيب الرئيسي، ألا وهو أن أزواج الثقيلة والخفيفة سلسلة من الغلوبولين المناعي البشري تصبح نأت في هذه العملية. إنتاج الهجينة مع الخلايا B الإنسان أو التحول EBV يتغلب على هذا العائق.
نستخدم إصابة الخلايا B الغدة الصعترية مع EBV في تركيبة مع بولكلونل B تحفيز الخلايا عبر تول مثل مستقبلات 9 (TLR-9) 6،12.
في هذه الورقة، ونحن تصف بالتفصيل التكنولوجيا التي نستخدمها لتطوير الأجسام المضادة البشرية مفتش، مع لمحة كاملة من جميع الخطوات من PBMC العزلة لفي المختبر توليد الأجسام المضادة. هذابروتوكول يمكن استخدامها لتحليل أي نوع من التشكيل مفتش البشري. في مختبرنا، والخلايا B تنتج الأجسام المضادة مفتش تم فصلها بنجاح من بقية PBMCs بعد الفرز. خمسون خلايا B فرز 8 ومن ثم يمكن مطلي في لوحات متعددة جيدا وخلد من قبل EBV وTLR-9 التنشيط، للتوسع نسيلي خلايا B واحدة. كما الخلايا المغذية، وقد استخدمت الخلايا الليفية من أنسجة الرئة الجنينية البشرية، خط خلية wi38، مما يسهل التصور من الخلايا B خلد. من هذه الخلايا B، متواليات من قيوده الثقيلة والخفيفة من الغلوبولين المناعي يمكن الحصول عليها عن طريق PCR، والجينات الأجسام المضادة "استنساخ في الغلوبولين المناعي G ناقلات التعبير وأنتجت في المختبر. باستخدام هذه التقنية، والأجسام المضادة وحيدة مع بالضبط نفس تسلسل الأجسام المضادة الموجودة في الجهة المانحة يمكن دراستها.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، وتعرض كل الخطوات لتوليد الأجسام المضادة مفتش من PBMCs الإنسان في التفاصيل. ويشمل هذا البروتوكول بعض المزايا أكثر من التقنيات التي تم نشرها مسبقا. واحدة من المزايا هو أن الأجسام المضادة المنتجة يحافظ على السلاسل الثقيلة والخفيفة الموافق الزوج الأصلي ف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
عقد البحوث ميغيل سيرفيت (ISCIII CD14 / 00032) إلى (GN-G). زمالة من المنظمة الهولندية للأبحاث "كلية الدراسات العليا في برنامج العلوم العصبية بالحركة" العلمية (022005019) إلى (CH).
المنح المقدمة من الأميرة بياتريس فون (مشروع WAR08-12) وجمعية الفرنسية مناهضة ليه الاعتلالات العضلية إلى (PM-M)؛ فضلا عن زمالة شفني من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (916.10.148) زمالة مؤسسة الدماغ هولندا (FS2008 (1) -28) والأميرة بياتريس فون (مشروع WAR08-12) (لML ).
نشكر Jozien اليشب لمساعدتها في B-خلية الترتيب بواسطة التدفق الخلوي.
Materials
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
References
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
- Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
- Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
- Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
- Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
- Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
- Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan … [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
- Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
- Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
- Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
