Generasjon av rekombinant humant IgG monoklonale antistoffer fra udødelig Ordnet B Cells
Summary
Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.
Abstract
Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.
Introduction
Målet med denne artikkelen er å beskrive i detalj en metode for å generere og karakter humane IgG monoklonale antistoffer hentet fra humane perifere mononukleære blodceller (PBMC).
Interessen for å studere humane antistoffer har vokst i mange ulike forskningsfelt. Spesielt mange forskningsgrupper er interessert i patologi forårsaket av auto-antistoffer 1-3. Vi har klonet og karakterisert patogene autoantistoffer 1. Studiet av auto-antistoffer kan bidra til å identifisere sine mål og utvikle terapeutiske strategier, for eksempel ved å bruke konkurren antistoffer 4. Videre kan studiet av humane antistoffer også være av interesse i andre dvs. innen forskning, for å vurdere immunresponsen etter vaksinering 5, for å karakterisere antistoffprofil av individer som ble eksponert og ble motstandsdyktig mot visse patogener 6, eller for å studere hvilke antistoffer er idet naturlige repertoaret 7,12.
Flere teknikker er blitt utviklet for å generere rekombinante humane monoklonale antistoffer 8-12; De fleste av disse bruke fag-display og B-celle immortalisering. Bruken av fagdisplay har blitt mye brukt for oppdagelsen av nye antistoffer 13. Men den har en stor ulempe, nemlig at de tunge og lette kjede parene av det humane immunoglobulin blir dissosiert i prosessen. Fremstilling av hybridomer med humane B-celler eller EBV-transformasjon overvinner denne ulempe.
Vi bruker infeksjon av tymiske B-celler med EBV i kombinasjon med polyklonale B-celle stimulering via Toll-like receptor 9 (TLR-9) 6,12.
I denne artikkelen beskriver vi i detalj den teknologien som vi bruker for utvikling av IgG humane antistoffer, med en komplett oversikt over alle trinnene fra PBMC isolasjon til in vitro antistoff generasjon. DetteProtokollen kan brukes for analyse av hvilken som helst type av humant IgG-profil. I vårt laboratorium, er B-celler som produserer IgG-antistoffer blitt separert fra resten av PBMC etter sortering. Femti sortert B-celler 8 kan deretter bli sådd ut i multi-brønnplater og udødeliggjort ved EBV og TLR-9-aktivering, for klonal ekspansjon av enkelt B-celler. Som mateceller, har fibroblaster fra human embryonisk lungevev blitt brukt, cellelinje WI38, som muliggjør visualisering av de udødeliggjorte B-celler. Fra disse B-celler, kan sekvensene av de tunge og lette kjeder av immunoglobulin oppnås ved PCR, og de antistoffer gener klonet i immunoglobulin G ekspresjonsvektorer og produsert in vitro. Ved hjelp av denne teknikken kan enkle antistoffer med nøyaktig det samme antistoff-sekvensen befinner seg i samme donor studeres.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskriptet, er alle trinnene for generering av IgG antistoffer fra menneskelige PBMCer presenteres i detalj. Denne protokollen inneholder noen fordeler i forhold til tidligere publiserte teknikker. En av fordelene er at det antistoff som frem holder de tunge og lette kjeder som svarer til den opprinnelige paret i B-celle-klon. Identifiseringen av IgG antistoffer kan gjøres på en hvilken som helst type menneskelig donor, og det er ikke behov for forverring av immunresponsen på grunn av vaksinering 5.</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning kontrakt Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00 032) til (GN-G.). Fellowship fra Nederland Organisasjonen for Scientific Research "Graduate School of Translasjonell Neuroscience Program" (022005019) til (CH).
Tilskudd fra Prinses Beatrix Fonds (Prosjekt WAR08-12) og Foreningen Française contre les Myopatier til (PM-M.); samt av en Veni Brorskap nederlandske organisasjonen for Scientific Research (916.10.148) et fellesskap av Brain Foundation of the Netherlands (FS2008 (1) -28) og Prinses Beatrix Fonds (Prosjekt WAR08-12) (til ML ).
Vi takker Jozien Jaspers for hennes hjelp i B-celle sortering av flowcytometri.
Materials
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µL, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
References
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
- Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
- Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
- Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
- Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
- Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
- Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan … [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
- Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
- Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
- Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
