الحقن في العضل وإلى جانب لوحات السيارات نهاية: نهج المناظير لمكوك الراسمات مباشرة إلى الخلايا العصبية للسيارات
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
الأمراض التي تؤثر على سلامة الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي هي من بين الحالات العصبية الأكثر إضعافا. على مدى العقود الماضية، وقد وفرت تطوير عدة نماذج حيوانية من هذه الاضطرابات العصبية والعضلية المجتمع العلمي مع سيناريوهات العلاجية المختلفة التي تهدف إلى تأخير أو عكس تطور هذه الشروط. من خلال الاستفادة من آلية الوراء من الخلايا العصبية، واحدة من هذه الطرق كان لاستهداف عضلات الهيكل العظمي لمكوك الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي المقابلة. على الرغم من مرة واحدة واعدة، وقد أعاق نجاح نهج تسليم هذا الجين من قبل عدد دون المستوى الأمثل من الخلايا العصبية الحركية transduced فقد أظهرت حتى الآن أن تحقق. لوحات السيارات نهاية (البرلمان الأوروبي) هي مناطق متخصصة للغاية على الجهاز العضلي والهيكل العظمي التي هي على اتصال مباشر متشابك إلى الحبل الشوكي α الخلايا العصبية الحركية. في هذا الصدد، من المهم أن نلاحظ أنه حتى الآن، والجهود المبذولة لretrogradelyوقدمت الجينات نقل إلى الخلايا العصبية الحركية من دون الإشارة إلى موقع المنطقة MEP في العضلات المستهدفة. هنا، نحن تصف بروتوكول بسيطة 1) للكشف عن الموقع الدقيق للأعضاء البرلمان الأوروبي على سطح عضلات الهيكل العظمي و2) لاستخدام هذه المعلومات لتوجيه تسليم العضلي واللاحق النقل إلى الوراء الأمثل لاستشفاف الوراء في الخلايا العصبية الحركية. نأمل الاستفادة من نتائج هذه التجارب تتبع في إجراء المزيد من الدراسات إلى التحقيق النقل إلى الوراء من الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري الحبل من خلال استهداف أعضاء البرلمان الأوروبي.
Introduction
فقدان السيطرة على حركة الطوعية التي تنتج من الحالات العصبية مثل مرض العصبون الحركي وspinal- وكذلك دوشين ضمور العضلات هو شرط المنهكة التي لديها تأثير دائم عالية وطويلة على الحياة كل يوم من الأفراد المتضررين. على مدى العقد الماضي، الجهود البحثية التي تهدف إلى وقف أو على الأقل تأخير الآثار الضارة لهذه الأمراض العصبية والعضلية وكانت أولوية بالنسبة لكثير من الأطباء والعلماء في جميع أنحاء العالم. وفي هذا الصدد، فإن الجيل الأخير من النماذج الحيوانية التي تحاكي هذه الأمراض العصبية والعضلية دورا أساسيا في الحصول على رؤى أساسية في آليات الفسيولوجية الكامنة وراء تطور وتقدم هذه الشروط 13/01. علاج هذه الأمراض العصبية والعضلية تتطلب الوصول المباشر إلى الحبل الشوكي ويمكن أن يتحقق عن طريق الحقن في النخاع الشوكي 14،15. واستهدفت التطورات الحديثة في مجال العلاج الجيني أيضا العضلات المخططة العليا والأطراف السفلية لمكوك الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة α التي تقع داخل القرن البطني للنخاع الشوكي 1،9-13. ومع ذلك، فقد فشلت هذه الاستراتيجية مرة واحدة واعدة لتحسين نتائج هذه الظروف العصبية. في حين أنه من الإنصاف أن نستنتج أن هذه النتائج السيئة يمكن أن يكون، جزئيا على الأقل، أن يعزى إلى انخفاض فعالية هذه الجينات الواقية، لا يمكن استبعاد فعالية منخفضة من هذه الأساليب توصيل الجينات.
لوحات السيارات نهاية (البرلمان الأوروبي) هي مناطق المتخصصة التابعة للmyofibres الهيكل العظمي التي يتم تحريكها من قبل المحطات محور عصبي من الألياف الحركية المحيطية الكبيرة القادمة من α الخلايا العصبية الحركية. معا، والنهايات الطرفية الألياف العصبية وأعضاء البرلمان الأوروبي تشكل الوصل العصبي العضلي، أي الموقع حيث يتم تشغيلها النبضات متشابك من قبل الافراج تقدمي من الناقل العصبي، الأستيل كولين. الأهم، والعلاقة بين الألياف العصبية الطرفية وأعضاء البرلمان الأوروبي هي ثنائية المباشرهtional، على الرغم من أن محركات مختلفة هي المسؤولة عن نقل الجزيئات وعضيات نحو وكذلك بعيدا عن العصبية somata 16-18. في ضوء هذه الاعتبارات التشريحية، ويبدو أن أعضاء البرلمان الأوروبي أن تكون الأهداف المفضلة للتسليم ونقل إلى الوراء لاحق من المادة الوراثية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة. في هذا السياق، فإنه ليس من المستغرب أن نجاح العصبون الحركي تنبيغ يعتمد إلى حد كبير على المسافة بين الحقن العضلي من ناقلات فيروسية وأعضاء البرلمان الأوروبي في العضلة 19-20. والمثير للدهشة، ومع ذلك، فإن الموقع الدقيق للمناطق MEP على myofibres من الفئران المخبرية والماوس، وهما نوعا من خيار لنموذج الأمراض العصبية والعضلية، لم تكن متاحة حتى وقت قريب.
أنتجنا خرائط شاملة للمنطقة MEP لعدة عضلات forelimb في الفئران والفأر 21-22. وفي الآونة الأخيرة، لقد أظهرنا تفاصيل تنظيم ص MEPegion لعدة عضلات hindlimb الماوس 23 ونحن في صدد تحليل ملامح البرلمان الأوروبي على hindlimb الفئران. في أيدينا، أعطى الحقن في العضل من استشفاف الوراء الموجهة إلى مناطق MEP بأكملها في هذه العضلات يؤدي إلى الخلايا العصبية الحركية أكثر المسمى التي تغطي قطاعات الحبل الشوكي أكثر مما ذكر سابقا. هنا نقدم البروتوكول الذي تم تطويره على مدى السنوات القليلة الماضية للكشف عن مكان وجود أعضاء البرلمان الأوروبي على السطح الخارجي، وكذلك في جميع أنحاء عمق hindlimb وforelimb العضلات في كل من الفأر والجرذ.
Protocol
Representative Results
Discussion
استهداف العضلي ونقل إلى الوراء لاحق من الجينات المحورة العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة α لعلاج تجريبي للحالة العصبية والعضلية ليست استراتيجية جديدة. على سبيل المثال، تم استخدام هذا الأسلوب تسليم تأخير الضمور العضلي العصبي في مراحل مختلفة من تطور الم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مركز بحوث الصحة والطب الوطني (NHMRC) منحة المشروع إلى RM
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neuroscience. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
