Intramuskulär injektion Längs motoränden Plates: en minimalinvasiv metod för Shuttle Tracers Direkt i motoriska nervceller
Summary
The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.
Abstract
Sjukdomar som påverkar integriteten hos ryggmärgs motoriska nervceller är bland de mest försvagande neurologiska tillstånd. Under de senaste decennierna har utvecklingen av flera djurmodeller av dessa neuromuskulära sjukdomar, förutsatt att forskarsamhället med olika terapeutiska scenarier som syftar till att fördröja eller vända den utvecklingen av dessa villkor. Genom att dra nytta av den bakåtsträvande maskiner av neuroner, har en av dessa metoder varit att rikta skelettmuskler för att transfer terapeutiska gener till motsvarande ryggmärgs motoriska nervceller. Fast en gång lovande, har framgången för en sådan genleverans tillvägagångssätt hämmats av sub-optimala antalet omvandlade motoriska nervceller har hittills visat sig ge. Motor ändplattor (ledamöter) är högt specialiserade områden på skelettmuskulaturen som är i direkt synaptiska kontakt med ryggmärgen α motoriska nervceller. I detta sammanhang är det viktigt att notera att hittills ansträngningarna att retrogradöverförings gener i motomeuroner gjordes utan hänvisning till platsen för MEP-regionen i de riktade muskler. Här beskriver vi ett enkelt protokoll 1) för att avslöja den exakta platsen för ledamöterna på ytan av skelettmuskulatur och 2) att använda denna information för att styra intramuskulär leverans och efterföljande optimal bakåtsträvande transport av bakåtsträvande spårämnen i motoriska nervceller. Vi hoppas att utnyttja resultaten från dessa spårningsförsök i fortsatta studier till undersöker bakåtsträvande transport av terapeutiska gener till ryggmärgen motoriska nervceller genom inriktning av ledamöterna.
Introduction
Förlusten av kontroll av frivillig rörelse som ett resultat av neurologiska sjukdomar såsom motorneuronsjukdom och spinal- liksom Duchenne muskelatrofi är ett försvagande tillstånd som har hög och långvarig påverkan på vardagen hos drabbade individer. Under det senaste decenniet har forskningsinsatser som syftar till att stoppa eller åtminstone fördröja de skadliga effekterna av dessa neuromuskulära sjukdomar varit en prioriterad fråga för många kliniker och forskare runt om i världen. I detta avseende har den senaste generationen av djurmodeller som efterliknar dessa neuromuskulära sjukdomar varit avgörande för att få grundläggande insikter i de fysiologiska mekanismer som ligger bakom utvecklingen och utvecklingen av dessa villkor 1-13. Behandling av dessa neuromuskulär sjukdom kräver direkt tillgång till ryggmärgen och kan åstadkommas genom ryggmärgs injektioner 14,15. Senaste framstegen inom genterapi har också riktat de tvärstrimmiga musklerna i övre ochnedre extremiteterna till shuttle terapeutiska gener till de motsvarande α motoriska nervceller som är belägna inom det ventrala hornet av ryggmärgen 1,9-13. Detta har dock en gång lovande strategi misslyckats med att förbättra resultatet av dessa neurologiska sjukdomar. Även om det är rimligt att dra slutsatsen att dessa dåliga resultat kan vara, åtminstone delvis, tillskrivas den låga effektiviteten hos dessa skyddande gener, kan man inte utesluta den låga effektiviteten hos dessa gen leveranssätt.
Motor ändplattor (ledamöter) är specialiserade regioner i skelett myofibrerna som indragna av axonet terminaler stora perifera motorfibrer med ursprung från α motoriska nervceller. Tillsammans de perifera nervfiberändarna och ledamöterna bildar den neuromuskulära förbindelsen, det vill säga den plats där synaptiska impulser utlöses av antero frisättning av signalsubstansen acetylkolin. Viktigare är bi-direk förhållandet mellan perifera nervfibrer och ledamöternanella, även om olika motorer är ansvariga för transport av molekyler och organ mot samt bort från neuron somata 16-18. I ljuset av dessa anatomiska överväganden parlamentsledamöterna verkar vara de mål för val för leverans och efterföljande retrograd transport av genetiskt material till de motsvarande motorneuronerna. I detta sammanhang är det inte förvånande att framgången för motorneuron omvandling beror mycket på avståndet mellan intramuskulär injektion av virala vektorer och muskelns ledamöter 19-20. Emellertid överraskande, den exakta platsen för MEP zoner på myofibrerna av laboratorie råtta och mus, de två arter av val för att modellera neuromuskulära sjukdomar, var inte tillgängliga förrän nyligen.
Vi har tagit fram omfattande kartor över MEP regionen för flera forelimb muskler i råtta och mus 21-22. På senare tid har vi visat detaljerna i organisationen av MEP rEgion för flera muskler mus bakbenen 23 och vi analyserar för närvarande särdragen hos parlamentsledamöterna på råtta bakbenen. I våra händer, intramuskulära injektioner av retrograda spårämnen riktade mot hela MEP zoner i dessa muskler gav upphov till flera märkta motoriska nervceller som spänner mer ryggmärgssegment än vad som tidigare rapporterats. Här presenterar vi det protokoll som har utvecklats under de senaste åren för att avslöja platsen för ledamöterna på den yttre ytan liksom hela djupet av bakbenen och framben muskler i både mus och råtta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intramuskulär inriktning och efterföljande bakåtsträvande överföring av terapeutiska transgener till motsvarande α motoriska nervceller för experimentell behandling av neuromuskulär tillstånd är inte en ny strategi. Till exempel, har denna leveransmetod använts för att fördröja neuromuskulära degeneration i olika stadier av ALS progression i SOD1 möss och råttor 1,9-12 samt i möss med SMA 13. Även lovande, har effekten av dessa genterapi scenarier varit begränsade. I detta avse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en National Health & Medical Research Centre (NHMRC) projektbidrag till RM
Materials
| Fluoro-Gold | Fluorochrome, LLC | Nil | Diluted to 5% |
| Drummond PCR Micropipets 1-10µl | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | accompanied with plungers |
| Acetylthiocholine Iodide | Sigma Life Science | A5751-25G | |
| Copper(II) Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 61230-500G-F | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 25608-930 | |
| Glycine | Ajax Finechem | 1083-500G | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin | Life Technologies | D-3312 | Diliuted in distilled water |
| Isothesia | Provet | ISOF00 | 1000mg/g Isoflurane inhalation vapour |
| Autoclip 9mm Wound Clips | Texas Scientific Instruments, LLC | 205016 | |
| Lethabarb Enthanasia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd. | LETHA450 | |
| Formaldehyde Solution | Ajax Finechem | A809-2.5L PL | |
| SuperFrost Plus glass slides | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Ammonium Sulphide | Sigma-Aldrich | A1952 | Diluted to 10% |
| Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride) | Astrazenca | Diluted to 0.25% |
References
- Kaspar, B. K. Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model. Science. 301 (5634), (2003).
- Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease. Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).
- Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).
- Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).
- Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression. Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).
- Van Den Bosch, L. Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis. J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).
- Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).
- Garrett, C. A., et al. DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy). Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).
- Bordet, T., et al. Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice). Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).
- Acsadi, G., et al. Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).
- Azzouz, M., et al. VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model. Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).
- Suzuki, M., et al. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS. Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).
- Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice. Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).
- Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).
- Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS. Brain Res. 1185, 256-265 (2007).
- Schnapp, B. J., Reese, T. S. Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles. Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).
- Vale, R. D. The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Schiavo, G., Fainzilber, M. Cell biology: Alternative energy for neuronal motors. Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).
- Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study. Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).
- Van Campenhout, A., Molenaers, G. Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin. Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb. Neuroscience. 200, 19-30 (2012).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Front Neurol. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
- Baumgartner, B. J., Shine, H. D. Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor. Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).
- Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection. PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).
