Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Este trabajo describe la síntesis de un no-emisión, cyclometalated Ir (III), Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), lo que provoca una señal fosforescente rápida, de larga vida cuando se coordina a una histidina que contiene proteína inmovilizada en la superficie de una partícula magnética. Síntesis de Ir1, con altos rendimientos, es completa O / N e implica la separación de los padres cyclometalated Ir (III) dímero cloro-puente en dos equivalentes del complejo solvatada. Para confirmar la especificidad, varios aminoácidos se probaron para la actividad de coordinación cuando se añade a la sonda sintetizada, y sólo histidina provocó una respuesta de la señal. Usando BNT-II, un mimético de péptido ramificado de la malaria biomarcador Histidina Rich Protein II (pfHRP-II), la sonda de iridio se validó como una herramienta para la detección de HRP-II. Se observaron efectos de enfriamiento en la titulación BNT-II / Ir1 cuando se compara con L-histidina / Ir1, pero estos se atribuyeron al impedimento estérico y triplet temple estado. Biocapa interferometría se utilizó para determinar la cinética en tiempo real de la interacción de Ir1 con BNT-II. Una vez que el sistema se ha optimizado, se encontró que el límite de detección de rcHRP-II usando la sonda a ser 12,8 nM en solución. Cuando esta proteína se inmoviliza sobre la superficie de una partícula de agarosa magnético 50 m, el límite de detección fue de 14,5 nM. La respuesta robusta de la señal de esta sonda inorgánico, así como su flexibilidad de uso en solución o inmovilizado en una superficie, puede prestarse hacia una variedad de aplicaciones, desde el uso de diagnóstico para formación de imágenes.
Colorimétricos y etiquetado fluorescente es un método importante para la detección y el seguimiento de las moléculas bioquímicas y procesa 1,2. Los marcadores fluorescentes más comunes son colorantes orgánicos de bajo peso molecular 3,4, pero estas moléculas no siempre tienen propiedades ópticas ideales. Los tintes fluorescentes son propensos a photobleaching, a menudo tienen pequeños desplazamientos de Stokes, y puede tener la superposición de espectros de excitación y emisión. Etiquetado colorimétrica se realiza generalmente mediante el uso de marcadores enzimáticos, que tienen una señal amplificada útil en 5,6 cuantificación inmunoensayo. Estas enzimas también tienen sus inconvenientes, incluyendo fotosensibilidad, condiciones de reacción, y la vida útil sustrato corto. Estas propiedades tienden a requerir inmunoensayos y métodos de marcaje de proteínas que hacerse bajo condiciones bien controladas utilizando reactivos costosos.
Complejos de metales de transición emisivos se han explorado como un enfoque alternativo etiquetado for detección bioquímica. En particular, cyclometalated Ir (III) ha sido estudiado en el contexto de diodos emisores de luz orgánicos (OLED) 7-9 oxígeno de detección 10, 11 catálisis, y tinción de proteínas / célula 12-14. Alta fotoestabilidad y la eficiencia cuántica hacen esta clase de sondas de un buen candidato para la detección de biomolécula 15,16. Se encontró previamente que cyclometalated Ir (III), de la forma [Ir (C ^ N) 2 (SOLV) 2] +, irreversiblemente unen histidina y provocar una respuesta de la señal azul-verde 12,17. Estos complejos son no-emisiva en el estado solvento, pero cuando histidina desplaza las moléculas de disolvente y se une al centro de metal, liberan una señal fosforescente intensa después de la irradiación UV de onda larga. Esta señal sólo se produce después de la sustitución del ligando, y es el resultado de un estado triplete de electrones se relaja al estado fundamental a través de la activación de la transferencia de carga de ligando de metal (3 MLCT) y la transferencia centrada ligando (3 LC) Rutas 8,15. Estos complejos potencialmente pueden ser utilizados como sondas de detección para las proteínas ricas en histidina.
Proteínas ricas en histidina y sus niveles de regulación son importantes en muchas enfermedades, incluyendo la cirrosis hepática, cáncer y trastornos trombótico. 18 Plasmodium falciparum histidina Rich Protein II (pfHRP-II), en particular, es un biomarcador bien validado para la infección del parásito de la malaria. Esta proteína es de 67 kDa y contiene 34% de histidina, sobre todo dentro de AHHAHHAAD repetir motivos característicos 19. Estas repeticiones de histidina pueden unir iones metálicos libres 19 y 20 complejos de hemo en la sangre de acogida. pfHRP-II se detecta comúnmente en entornos de bajos recursos mediante las pruebas de diagnóstico rápido inmunocromatográficas (PDR), pero estas pruebas son a menudo inexactas debido a las condiciones de la muestra, la baja concentración de biomarcadores, normas de fabricación de pobres, y la degradación de anticuerpos 21.
<p class="Jove_content"> sondas fosforescentes a base de metal, tales como el cyclometalated Ir (III) descritos anteriormente son opciones atractivas para la detección de pfHRP-II debido a su unión selectiva de histidina y sus propiedades estables y de emisión eficiente. En este trabajo, el uso de [Ir (ppa) 2 (H2O) 2] + (Ir1) para detectar BNT-II, un mimético péptido ramificado de pfHRP-II se explora 22. Cinética de esta interacción fueron monitorizados en tiempo real usando técnicas de interferometría biocapa. El ensayo también fue adaptado a un formato de ELISA de tipo on-talón, donde se lograron límites nanomolares de detección. Este ensayo tiene ventajas sobre los ELISA tradicionales, ya que se puede realizar en menos de 2 horas con reactivos de anticuerpo libre, en lugar del 4-5 hr y reactivos biológicos requeridos con ELISAs típicos.Como herramientas de diagnóstico basadas en micropartículas vienen a la vanguardia de la tecnología de diagnóstico moderno, la detección de biomoléculas diana directamente sobre la superficie de la partícula es una gran ventaja. Métodos de detección molecular tradicionales, tales como ELISA y PCR, son ventajosas, en que puedan alcanzar límites muy bajos de detección 25. Sin embargo, estos ensayos requieren extensas reactivos y protocolos largos. Este ensayo fue diseñado para imitar las interacciones de tipo sándwich ELISA sin los requisitos de reactivos (Figura 5) y tiempo. Adicionalmente, el costo de la sonda Ir1 por muestra se estimó en alrededor de un centavo, mientras que el coste de anticuerpos para un ELISA típico es $ 0,20-0,30 por muestra.
Dado que los métodos descritos anteriormente se basan en una sonda de iridio cyclometalated para la detección del biomarcador malaria, esta sonda no sería susceptible a los modos de fallo comunes a otros métodos de detección (es decir. Quenchi fluoróforong y la degradación de anticuerpo / enzima). La histidina es único en sus propiedades de unión a metal. El trabajo descrito se aprovecha de este fenómeno mediante la sustitución de los anticuerpos en un típico ELISA tipo sándwich con complejos de metal que contiene. Ni (II) NTA captura rcHRP-II en la superficie de la partícula y Ir1 señala la presencia de la proteína. El paso más crítico en el ensayo está permitiendo que las partículas magnéticas se mezclen con la muestra y la sonda. En una placa de 96 pocillos ELISA, las biomoléculas y reactivos alcanzan el equilibrio con la superficie bidimensional de la parte inferior del pozo. Las partículas magnéticas tienen la tendencia a sedimentarse fuera de la solución debido a su núcleo de hierro-óxido densa, lo que reduciría los sitios de unión disponibles. Por lo tanto, las partículas deben ser mezclados durante el tiempo de ensayo para asegurar la unión máxima.
En el diseño de un reactivo para el diagnóstico de enfermedades, hay que tener en cuenta la forma de muestra del paciente, así como la concentración fisiológica del biomarcador. Pormalaria, la concentración de PF HRP-II en la sangre de un paciente puede variar de baja a alta picomolar nanomolar. Mientras que este ensayo es clínicamente relevante para los niveles más altos de infección, necesita el límite de detección para ser mejorado con el fin de detectar pacientes asintomáticos con bajo picomolar circulante pf HRP-II. En los métodos descritos anteriormente, el "encendido" señal generada por Ir1 se produce en presencia de histidina. Mientras que el biomarcador malaria es rica en histidina, otras proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano y glicoproteína rica en histidina, se provocan una respuesta de la señal con la sonda. Esto a su vez conducir a diagnósticos falsos positivos. Esto hace que la captura de la proteína en la superficie de la partícula un paso beneficioso, en que la proteína de interés se puede extraer rápidamente de una muestra de paciente. Además, el diseño de una sonda bifuncional, que las parejas de un péptido rico en histidina a un elemento de reconocimiento molecular robusta (es decir. Aptámero), Podría añadir otra capa de especificidad para el ensayo. El péptido sería cargado con iridio antes del acoplamiento a la aptámero. En tal diseño, la sonda Ir1 estable todavía se puede utilizar mientras que el logro especificidad de la diana con el aptámero. Esto permitiría la aplicación de la sonda para detectar nativo HRP-II en una matriz compleja (es decir. Plasma o sangre entera) y reducir los efectos de unión no específicos. Con el fin de mejorar aún más la señal de pruebas de diagnóstico rápido, el ensayo podría ser incorporado en un sistema electroquimioluminiscente (ECL), donde pf HRP-II se puede detectar en el PDR como una lectura electroquímica 26. Esta sonda iridio próxima generación mejoraría en gran medida nuestro ensayo en grano ELISA para la detección de biomarcadores de la enfermedad.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |