Isolering af leukocytter fra det murine væv på maternel-føtal grænseflade

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

Immun tolerance i graviditeten kræver, at immunsystemet hos moderen undergår markante ændringer for at acceptere og give næring fosteret udvikle. Denne tolerance er initieret under coitus, etableret under befrugtning og implantation, og opretholdes under hele graviditeten. Aktive cellulære og molekylære mediatorer af maternel-føtal tolerance er beriget på stedet for kontakt mellem føtale og maternelle væv, kendt som den maternelle-føtale interface, som omfatter moderkagen og livmoderen og decidua væv. Denne grænseflade består af stromale celler og infiltrerende leukocytter, og deres overflod og fænotypiske karakteristika ændres i løbet af graviditeten. Infiltrerende leukocytter på maternel-føtal grænseflade indbefatter neutrofiler, makrofager, dendritiske celler, mastceller, T-celler, B-celler, NK-celler og NKT-celler, der samlet udgør det lokale mikromiljø, som opretholder graviditet. En ubalance mellem disse celler eller enhver inappropriate ændring i deres fænotyper betragtes som en mekanisme for sygdom i graviditeten. Derfor studiet af leukocytter, der infiltrerer maternel-føtal interface er afgørende for at belyse de immune mekanismer, der fører til graviditetsrelaterede komplikationer. Beskrevet heri er en protokol, som anvender en kombination af forsigtig mekanisk dissociation efterfulgt af et robust enzymatisk disaggregering med et proteolytisk og collagenolytisk enzymatisk cocktail at isolere de infiltrerende leukocytter fra de murine væv ved maternel-føtal interface. Denne protokol muliggør isolering af høje antal af levedygtige leukocytter (> 70%) med tilstrækkelig konserverede antigene og funktionelle egenskaber. Isolerede leukocytter kan derefter analyseres ved adskillige teknikker, herunder immunfænotype, cellesortering, imaging, immunoblotting, mRNA-ekspression, cellekultur og in vitro funktionelle assays såsom blandede leukocyt reaktioner, proliferation eller cytotoksicitetsassays.

Introduction

Immuntolerance i graviditeten er en periode, hvor markante ændringer forekommer inden immunsystemet hos moderen. Disse ændringer tillader moderen at tolerere fosteret, en semi-allogent transplantat ^1. Fosteret udtrykker faderlige større histokompatibilitetskompleks (MHC) antigener ^2, og fosterceller er blevet fundet i den maternelle cirkulation ^3; imidlertid fosteret ikke afvist ^4,5. Denne gåde er ikke fuldt forstået.

Den seneste hypotese, at maternel-føtal tolerance er skabt under coitus og befrugtning ^6,7 og vedligeholdes for at opretholde en fuld sigt graviditet ^8-10. En fordeling af dette maternel-føtal tolerance betragtes som en mekanisme for sygdom i tidlige og sene stadier af graviditeten ^10-16. Maternel-føtal tolerance involverer deltagelse af forskellige leukocyt subpopulationer, herunder T-celler (regulerende T-celler, Th1-celler, Th2 celler og Th17 celler), macrophages, neutrofiler, mastceller, NK-celler, og NKT celler, dendritiske celler og B-celler, at ændring i tæthed og lokalisering hele graviditeten ^15,17-19. Maternel-føtal tolerance er beriget på maternel-føtal grænseflade ²⁰ – den anatomiske sted, hvor immunsystemet hos moderen interagerer med føtale antigener ^20,21.

Den maternel-føtal interface er skabt under placentation når føtale extravillous trophoblastceller invadere slimhinden ^22-24. På den føtale side af denne grænseflade, de membraner, der omgiver fosteret skabe en specialiseret epiteloverflade i moderkagen, og syncytiotrophoblast cellerne styrer udvekslingen af næringsstoffer gennem deres direkte kontakt med moderens blod ^22. På moderens side af grænsefladen, decidua rekrutterer en heterogen pulje af leukocytter, som i mus udgør 30% til 50% af alle moderhindeceller. Ud over deres deltagelse i MATERNal immun tolerance, disse celler er vigtige bidragydere til forskellige processer under graviditeten, fx., beskyttelse af den reproduktive tarmkanalen fra infektioner, befrugtning, embryo implantation ^7,25, decidua angiogenese ^26, vaskulær remodellering ^24,27, trofoblast invasion ^28, placenta udvikling ^24,25, og i sidste ende, arbejdskraft og levering ^15,17. Derfor er studiet af de involverede i maternel-føtal tolerance leukocytter er afgørende for at belyse patogenesen af ​​graviditetsrelaterede komplikationer.

Mens anvendelsen af immunhistokemi og immunfluorescens har genereret data til direkte visualisering og lokalisering af uterin, decidua eller placenta leukocytter ^29,30, flowcytometri analyse har yderligere afsløret specifikke delmængder af leukocytter i hvert af disse væv ^31,32. Derudover flowcytometri er blevet anvendt til bestemmelse af massefylde og andelen af ​​maternal-føtal grænseflade leukocytter ³³ og ekspressionsniveauer af ekstracellulære og intracellulære proteiner ^8-10,34. Flowcytometrisk analyse af leukocytter ved maternel-føtal grænseflade kræver en enkelt-cellesuspension. For at isolere infiltrerende leukocytter fra decidua, livmoder og placenta væv, har to metoder til væv dissociation blevet anvendt: mekanisk og enzymatisk. Begge metoder tillader adskillelsen af ​​infiltrerede leukocytter fra den ekstracellulære matrix (ECM), i disse væv. Enzymatisk væv dissociation er overlegen i forhold til mekanisk væv dissociation da det tillader et højere udbytte af leukocytter med mindre forskydningskraft-associeret skade ^35. Derfor kræver mekanisk væv dissociation pooling væv ^36, hvilket kan øge variationen og heterogenitet af prøverne. Alligevel kan mekanisk dissociation være valg, når antigenet af interesse kan ændres ved enzymatisk dissociation eller når funktionaliteten af ​​cellens af interesse behov for at blive bevaret (f.eks., cytotoksicitet NK-celler) ^35.

Anvendelsen af ​​proteolyse med specifikke enzymer til at nedbryde ECM eliminerer de lave udbytter observeret med mekanisk dissociation. Flere undersøgelser har rapporteret brugen af trypsin ^32, collagenase ^37, DNase ^31, dispase ^38, og kommercielle cocktails af forskellige enzymer ^32,39. Imidlertid må arten og koncentrationen af ​​forskellige enzymer og varigheden af ​​fordøjelsen blive omhyggeligt defineret og valideret for at sikre opretholdelse af integriteten af ​​celleoverflade antigene epitoper, der kræves for immunfænotypebestemmelse. De forskellige overfladestrukturer er differentielt modtagelige for ødelæggelse af forskellige enzymer, med nogle enzymer, såsom trypsin, er berygtet for stripping leukocyt overflade epitoper genkendt af mange monoklonale antistoffer.

Indført heri er en fremgangsmåde under anvendelse af en proteolytic og collagenolytisk enzymatisk cocktail, kaldet Accutase. Denne enzymatiske opløsning er blid nok, mens den stadig effektiv i dissociering murine væv ved maternel-føtal grænseflade, og kræver ikke tilsætning af andre dissocierende reagenser eller serum Dissociation at afslutte reaktionen. Desuden er det klar til brug som leveret, og selv tidspunktet for dissociation skal valideres, er det mere robust end de ovenfor anførte enzymer ^40,41.

Udnyttelsen af ​​en kombination af begge typer af væv opdeling forbedrer kvaliteten og mængden af ​​celler opnået; dermed har flere undersøgelser gennemført den kombinerede anvendelse af mekanisk og enzymatisk dissociation med tilfredsstillende resultat ^31,32,37. Den her beskrevne protokol blev etableret og valideret i vores laboratorium; det bruger en kombination af en forsigtig mekanisk dissociation efterfulgt af et robust enzymatisk opdeling. Denne protokol tillader isoleringen og yderligere undersøgelse afde infiltrerende leukocytter i murine væv ved maternel-føtal grænseflade (livmoder, decidua og placenta). Følgende protokol opretholder også integriteten af ​​celleoverflademarkører og udbytter nok levedygtige celler til efterfølgende anvendelser som påvist ved flowcytometrisk analyse. Endelig er denne protokol bevarer sammenhængen i forberedelse celle til analyse og sammenligning af forskellige murine væv der udgør maternel-føtal interface.

Protocol

Før du arbejder med de i denne protokol prøver, skal dyr etisk godkendelse gives af den lokale Research etiske komité og Institutional Review Boards. Når du arbejder med dyreblod, celler eller farlige stoffer, som er nævnt i denne protokol, skal de korrekte biosikkerhed og laboratorieudstyr sikkerhedstiltag følges. 1. Mus Håndtering og Tissue Collection Forbered en steril arbejdsstation og få sterile værktøjer til væv samling. Disse værktøjer vil omfatte store og små…

Representative Results

Dissektion af murine væv fra maternel-føtal grænseflade er vist i figur 1; denne procedure omfatter åbning af bughulen (figur 1A, B), uterine horn (Figur 1C), herunder de implantationssteder (figur 1D), og indsamlingen af de uterine væv (Figur 1E), placenta (figur 1F), og decidua væv (figur 1G) til 16,5 dpc. Figur 2 viser morfologien af isolerede makrofager (F4 / 80 +) indsamles f…

Discussion

Indsamlingen af ​​sammenhængende data, der registrerer overflod og fænotypiske karakteristika infiltrerende leukocytter ved maternel-føtal interface er afgørende for at forstå patogenesen af ​​graviditetsrelaterede komplikationer. Adskillige teknikker er blevet beskrevet som letter isoleringen af infiltrerende leukocytter fra de murine væv på maternel-føtal grænseflade hele graviditeten ^{31,38,39,43-46.} Men hver teknik er forskellige, anvender forskellige enzymer eller enzymkombinationer, kræ…

Materials

			Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies			(Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin			(BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer			(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
			Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope