Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Summary

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Abstract

Immuntoleranz bei Schwangerschaft erfordert, dass das Immunsystem der Mutter erfährt Scheidungsänderungen, um zu akzeptieren und zu pflegen sich entwickelnden Fötus. Diese Toleranz wird während des Koitus eingeleitet, während der Befruchtung und Implantation gegründet und während der Schwangerschaft beibehalten wird. Aktive zellulären und molekularen Mediatoren von Mutter und Fötus Toleranz werden an der Stelle des Kontaktes zwischen fetalen und mütterlichen Gewebe, wie die Mutter und Fötus-Schnittstelle, die die Plazenta und die Gebärmutter und dezidualen Gewebe enthält bekannt bereichert. Diese Schnittstelle wird von Stromazellen und infiltrieren Leukozyten besteht, und deren Fülle und phänotypischen Eigenschaften im Laufe der Schwangerschaft zu ändern. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle umfassen Neutrophile, Makrophagen, dendritische Zellen, Mastzellen, T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, die zusammen das lokale Mikroumgebung, die Schwangerschaft aufrecht zu erstellen. Ein Ungleichgewicht zwischen diesen Zellen oder jede inappropriate Veränderung ihrer Phänotypen wird als ein Mechanismus der Erkrankung in der Schwangerschaft. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten, die die Mutter und Fötus Schnittstelle infiltrieren wesentlich, um die Immunmechanismen, die schwangerschaftsbedingten Komplikationen aufzuklären. Hierin ist ein Protokoll, das eine Kombination von leichter mechanischer Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung mit einem proteolytischen und kollagenolytischen Enzymcocktail, um die Infiltration von Leukozyten aus den Mäusegeweben an der mütterlich-fötalen Grenzfläche zu isolieren, verwendet. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung der hohen Zahl von lebensfähigen Leukozyten (> 70%) mit einer ausreichend konservierten antigenen und funktionellen Eigenschaften. Isolierten Leukozyten können dann durch verschiedene Techniken, einschließlich Immunphänotypisierung Zellsortierung, Imaging, Immunoblotting-mRNA-Expression, Zellkultur und in vitro funktionelle Assays wie gemischte Leukozytenreaktionen, Proliferation oder Zytotoxizität Assays analysiert werden.

Introduction

Immuntoleranz bei Schwangerschaft ist eine Periode, in Scheidungs ​​Veränderungen im Immunsystem der Mutter erfolgen. Diese Änderungen ermöglichen die Mutter auf den Fötus, eine semi-allogenen Transplantats ¹ zu tolerieren. Der Fötus drückt väterlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) -Antigene ² und fötalen Zellen im mütterlichen Kreislauf ³ gefunden worden ist; jedoch ist der Fötus nicht abgelehnt ^4,5. Dieses Rätsel ist nicht vollständig geklärt.

Die jüngste Hypothese besagt, dass Mutter und Fötus Toleranz während des Koitus erstellt und Befruchtung und ^6,7 gehalten, um eine volle Laufzeit der Schwangerschaft ^8-10 erhalten. Eine Aufschlüsselung dieser Mutter und Fötus Toleranz wird in der frühen und späten Stadien der Schwangerschaft ^10-16 als einen Mechanismus der Krankheit. Mutter und Fötus Toleranz beinhaltet die Mitwirkung der verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen, einschließlich T-Zellen (regulatorische T-Zellen, Th1-Zellen, Th2-Zellen, und Th17-Zellen), macrophages, Neutrophilen, Mastzellen, NK-Zellen, NKT-Zellen, dendritische Zellen und B-Zellen, die Änderung in der Dichte und Lokalisierung während der Schwangerschaft ^15,17-19. Der anatomischen Stelle, wo das Immunsystem der Mutter mit den fetalen Antigene ^20,21 interagiert – Mutter und Fötus Toleranz wird am Mutter und Fötus-Schnittstelle ²⁰ angereichert.

Die Mutter und Fötus-Schnittstelle wird während des Plazenta erstellt, wenn die fetalen extravillösen Trophoblastenzellen dringen in die Uterusschleimhaut ^22-24. Auf der fetalen Seite dieser Schnittstelle, die Membranen den Fötus umgibt, schaffen eine spezialisierte Epitheloberfläche innerhalb der Plazenta und die Synzytiotrophoblasten Zellen steuern den Stoffaustausch durch ihre direkten Kontakt mit Blut der Mutter ^22. Auf der mütterlichen Seite der Schnittstelle, rekrutiert die decidua einen heterogenen Pool von Leukozyten, die bei Mäusen verantwortlich für 30% bis 50% aller Deciduazellen. Zusätzlich zu ihrer Beteiligung an Maternal Immuntoleranz, diese Zellen sind wichtige Mitwirkende zu verschiedenen Prozessen während der Schwangerschaft, z. B. der Schutz der reproduktiven Fläche von Infektionen, Befruchtung, Embryoimplantation ^7,25, dezidualen Angiogenese ^26, vaskuläre Remodeling ^24,27, Trophoblastinvasion ^28, Plazenta Entwicklungs ^24,25, und schließlich Arbeit und Lieferung ^15,17. Daher ist die Untersuchung der Leukozyten in Mutter und Fötus Toleranz beteiligt wichtig, die Aufklärung der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen.

Während die Verwendung von Immunhistochemie und Immunfluoreszenz wurden Daten für die direkte Visualisierung und Lokalisierung von Gebärmutter-, decidual oder Plazenta Leukozyten ^29,30 erzeugt, Durchflusszytometrie-Analyse wurde weiterhin offenbart spezifische Untergruppen von Leukozyten, die in jedem dieser Gewebe ^31,32. Zusätzlich Durchflusszytometrie verwendet worden, um die Dichte und den Anteil von mater bestimmennal-fetalen Schnittstelle Leukozyten ³³ und Expression von extrazellulären und intrazellulären Proteinen ^8-10,34. Durchflusszytometrische Analyse von Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt eine Einzelzellsuspension. Um infiltrieren Leukozyten aus dem dezidualen, Gebärmutter und Plazenta-Gewebe zu isolieren, zwei Methoden der Gewebedissoziation verwendet: mechanische und enzymatische. Beide Verfahren ermöglichen die Trennung von infiltrierten Leukocyten aus der extrazellulären Matrix (ECM) dieser Gewebe. Enzymatische Gewebedissoziation überlegen ist mechanischen Gewebedissoziation, da es eine höhere Ausbeute an Leukozyten mit geringer Scherkraft-verbundenen Schäden ^35. Folglich mechanische Gewebedissoziation erfordert die Bündelung Gewebe ^36, das die Variabilität und Heterogenität der Proben erhöhen kann. Dennoch können mechanische Dissoziation der Wahl sein, wenn das Antigen von Interesse kann durch enzymatische Spaltung oder geändert werden, wenn die Funktionalität der Zelles von Interesse bewahrt werden müssen (z. B. Cytotoxizität von NK-Zellen) ^35.

Die Verwendung von Proteolyse mit spezifischen Enzymen, die ECM abbauen beseitigt die mechanische Dissoziation beobachtet geringe Ausbeuten. Mehrere Studien haben die Verwendung von Trypsin ^32, Collagenase ^37, DNase ^31, Dispase ³⁸ und kommerzielle Cocktails verschiedener Enzyme ^32,39 gemeldet. Jedoch muß die Art und Konzentration der verschiedenen Enzyme und die Dauer der Verdauung genau definiert und um zur Aufrechterhaltung der Integrität der Zelloberfläche antigene Epitope zur Immunphänotypisierung erforderlich sicherzustellen, validiert werden. Die verschiedenen Oberflächenstrukturen sind unterschiedlich anfällig für Zerstörung durch verschiedene Enzyme, mit einigen Enzymen, wie Trypsin, wobei berüchtigt Strippen von vielen monoklonalen Antikörpern erkannt Leukozyten Oberflächenepitope.

Hierin eingeführt ist ein Verfahren unter Verwendung eines proteolytic und kollagenolytische Enzymcocktail, genannt Accutase. Diese enzymatische Lösung ist sanft genug, während immer noch effizienter in distanziert Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle und erfordert nicht die Zugabe von anderen distanziert Reagenzien oder Serum, die Dissoziation Reaktion zu beenden. Darüber hinaus ist es gebrauchsfertig geliefert zu bedienen und, obwohl die Zeit der Dissoziation Annahmen validiert werden soll, ist robuster als die oben erwähnten Enzyme, ^40,41.

Die Verwendung einer Kombination beider Arten von Gewebe-Disaggregation verbessert die Qualität und die Menge der Zellen erhalten wird; Daher haben mehrere Studien die kombinierte Verwendung von mechanischen und enzymatischen Spaltung mit befriedigenden Ergebnissen ^31,32,37 implementiert. Das hier beschriebene Protokoll wurde eingerichtet und in unserem Labor validiert; Es verwendet eine Kombination eines leichten mechanischen Dissoziation gefolgt von einem robusten enzymatische Zerlegung. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung und die weitere Untersuchung vondie Infiltration von Leukozyten in Mausgeweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle (Uterus, Dezidua und Plazenta). Das folgende Protokoll unterhält auch die Integrität der Zelloberflächenmarker und Ausbeuten genügend lebensfähige Zellen für nachfolgende Anwendungen wie durch durchflusszytometrische Analyse demonstriert. Schließlich dieses Protokoll erhält die Konsistenz der Zellpräparation für die Analyse und den Vergleich von verschiedenen Mausgeweben zu komponieren die Mutter und Fötus-Schnittstelle.

Protocol

Vor der Arbeit mit den in diesem Protokoll genannten Proben müssen Tier ethische Genehmigung durch die lokalen Forschungsethikkommission und der Institutional Review Boards gegeben. Bei der Arbeit mit Tierblut, Zellen oder gefährliche Mittel, wie in diesem Protokoll erwähnt, müssen die richtige biologische Sicherheit und Laborsicherheitsmaßnahmen eingehalten werden. 1. Maus Handhabung und Gewebeentnahme Bereiten Sie eine sterile Arbeitsstation und erhalten sterile Werkzeuge f…

Representative Results

Die Präparation von Maus-Geweben von der mütterlich-fötalen Grenzfläche ist in Abbildung 1 gezeigt ist; Dieses Verfahren umfasst das Öffnen der Bauchhöhle (1A, B), Gebärmutterhörner (1C), die die Implantationsstellen (1D) und die Sammlung der Uterusgeweben (1E), Plazenta (1F) und Dezidua-Gewebe (1G) bei 16,5 dpc. 2 zeigt die Morphologie von isolierten Makrophagen (F4 / 80 +) aus…

Discussion

Die einheitliche Datenerhebung, die die Fülle und phänotypischen Eigenschaften der infiltrierenden Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zeichnet ist wesentlich für das Verständnis der Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen. Verschiedene Techniken wurden beschrieben, dass die Isolierung der infiltrierenden Leukozyten aus den Mäusegeweben am mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft ^{31,38,39,43-46} erleichtern. Aber jede Technik unterschiedlich ist, verwend…

Materials

			Magentic Cell Separation
MS Columns
Cell Separator
30μm pre separation filters
Multistand
15mL safe lock conical tubes
MACS Buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
Anti-mouse CD16/CD32
Anti-mouse extracellular antibodies			(Table 1)
Sodium azide
Bovine serum albumin			(BSA)
LIVE/DEAD viability dye
Fixation buffer solution
FACS Buffer			(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)
Trypan Blue Solution 0.4%
Fetal bovine serum
			Additional Instruments
Incubator with shaker
Flow cytometer
Centrifuge
Vacuum system
Incubator
Water bath
Cell counter
Microscope