के कार्यान्वयन<em> इन विट्रो</em> दवा प्रतिरोध Assays: चिकित्सकीय प्रासंगिक प्रतिरोध तंत्र Uncovering के लिए क्षमता बढ़ाने

Summary

नैदानिक ​​शुरुआत के बाद से पहले या करने के लिए – – लक्षित चिकित्सा विज्ञान के लिए दवा का विरोध व्यापक और प्रतिरोध के तंत्र की पहचान करने की जरूरत है विकल्प नैदानिक ​​प्रबंधन रणनीति के मार्गदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम इन तंत्रों की खोज में तेजी लाने का अनुक्रमण के साथ इन विट्रो में दवा प्रतिरोधी लाइनों की जोड़ी व्युत्पत्ति के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Abstract

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Introduction

मजबूत अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों और बेहतर डेटा विश्लेषणात्मक उपकरणों से ट्यूमर जीनोम का विस्तृत आणविक लक्षण वर्णन विशिष्ट प्रकार के कैंसर ^1,2 में महत्वपूर्ण आनुवंशिक परिवर्तन की खोज करने के लिए प्रेरित किया है। ऐसे HER2, बीसीआर-एबीएल, EGFR और ALK के रूप में इन आनुवंशिक घावों के उद्देश्य से निशाना बनाया उपचारों के विकास में काफी रोगियों ^1,2 के लिए जीवन की गुणवत्ता में सुधार हुआ है। प्रतिरोध अंततः के रूप में उभर हालांकि, इस दृष्टिकोण की विशिष्टता के बावजूद ज्यादातर एकल उपचार के लिए नैदानिक ​​प्रतिक्रिया उप इष्टतम किया गया है। हाल ही में, महत्वपूर्ण प्रगति लक्षित चिकित्सा विज्ञान के लिए प्रतिरोध के आणविक आधार को समझने में किया गया है। दिलचस्प, यह प्रतिरोध का एक प्रमुख तंत्र लगातार लक्ष्य / मार्ग गतिविधि शामिल है कि स्पष्ट होता जा रहा है। इस मामले में के रूप में, एण्ड्रोजन रिसेप्टर (एआर) प्रोस्टेट कैंसर के enzalutamide उपचार, एआर अपने आप में म्यूटेशन को सक्रिय बनाए रखने के संवर्धन के लिए होता है -directed एआर संकेत outpअवरोध करनेवाला ^3-5 की उपस्थिति में संघ राज्य क्षेत्र। इस ज्ञान में WT और उत्परिवर्ती-एआर समारोह में दोनों को दबाने के लिए जारी रख सकते हैं कि तीसरी पीढ़ी के विरोधी विकसित) 1 के लिए एक आक्रामक अभियान के लिए प्रेरित किया enzalutamide प्रतिरोधी पीसीए ³ और 2) चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए निशाना बनाया जा सकता है कि एआर सिगनल की संभावित नीचे की ओर नोड्स की पहचान । इसी प्रकार, इस तरह के EGFR, BRAF और एबीएल को निशाना बनाने वाले के रूप में अवरोधकों के अन्य वर्गों के लिए प्रतिरोध अक्सर मूल खेलों काइनेज मार्ग ¹ पुन: सक्रिय कि म्यूटेशन के लिए सीसा।

प्रतिरोध अनिवार्य रूप से सबसे अधिक रोगियों में उभर रहे हैं कि ज्ञान के साथ, दृष्टिकोण विकसित कर शीघ्रता से प्रभावी अनुवर्ती उपचारों के विकास की अनुमति होगी रोशनी करने के लिए इन तंत्रों में लाने के लिए। व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है कि एक दृष्टिकोण घ के लिए उत्तरदायी हो सकता है कि आनुवंशिक घावों में संवर्धन / depletions की पहचान के सापेक्ष उपचार-भोले या संवेदनशील ट्यूमर के लिए नैदानिक ​​आग रोक ट्यूमर के जीनोमिक्स का विश्लेषण करने के लिए हैगलीचा खोज। अपने वादे के बावजूद, त्वरित खोज में बाधा है कि इस दृष्टिकोण के दो प्रमुख देनदारियों देखते हैं। सबसे पहले, जीनोमिक पूछताछ के लिए ट्यूमर सामग्री के लिए समय पर पहुँच पाने के इलाज के लिए चिकित्सा से बढ़ने में एक महत्वपूर्ण बाधा के रूप में सेवा कर सकते हैं। ट्यूमर महत्वपूर्ण इंट्रा-tumoral विविधता ^6.7 पेश कर सकते हैं, क्योंकि दूसरे, प्रतिरोधी सेटिंग में आनुवंशिक घावों के असंख्य की deconvolution चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

इन चुनौतियों के प्रकाश में, प्रतिरोध तंत्र की प्रीक्लीनिकल खोज पर निर्भरता बढ़ गई है। इस दृष्टिकोण से पहले प्रतिरोध की शुरुआत के बाद इन तंत्र या तो पहले उपचार के लिए या सहन कि उन रोगियों में वैकल्पिक नैदानिक ​​प्रबंधन रणनीति मार्गदर्शन कर सकते हैं कि क्लिनिकल परीक्षण करने के लिए ¹ प्रमुख प्रतिरोध तंत्र की पहचान की अनुमति हो सकती है।

व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है कि ऐसा ही एक प्रीक्लीनिकल खोज उपकरण निष्पक्ष कार्यात्मक आरएनएआई स्क्रीन लागू करने के लिए है। परीक्षा के लिएमिसाल, Whittaker और सहयोगियों NF1 निरंतर हानि MAPK मार्ग सक्रियण ⁸ के माध्यम से आरएएफ और खल्क अवरोधकों के लिए प्रतिरोध मध्यस्थता करता है कि पहचान के लिए एक जीनोम पैमाने आरएनएआई स्क्रीन लागू होता है। NF1 में नुकसान के समारोह म्यूटेशन आरएएफ निषेध करने के लिए और सक्रियण ⁸ vemurafenib के लिए प्रतिरोधी मेलेनोमा ट्यूमर में आंतरिक रूप से प्रतिरोधी रहे हैं कि BRAF -mutant ट्यूमर कोशिकाओं में मनाया गया के रूप में इन निष्कर्षों को चिकित्सकीय प्रासंगिक होना पाया गया है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की सफलता के बावजूद, कई चिकित्सकीय प्रासंगिक लक्ष्यों को अक्सर संभवतः कारण इस दृष्टिकोण के नुकसान के समारोह पक्षपात करने, पहचान नहीं कर रहे हैं।

इसके विपरीत, प्रतिरोध तंत्र की प्रीक्लीनिकल खोज के लिए एक कम पक्षपाती उपकरण NGS आधारित जीनोमिक या transcriptomic रूपरेखा के साथ युग्मित ब्याज की मिश्रित करने के लिए लंबे समय तक निवेश के माध्यम से प्रतिरोधी सेल लाइनों की पीढ़ी शामिल है। यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक सहज की पहचान करने के लिए कई समूहों द्वारा लागू किया गया हैप्रतिरोध ^5,9,10 सक्षम है कि आवर्तक एकल nucleotide वेरिएंट या अभिव्यक्ति परिवर्तन। उदाहरण के लिए, एआर में बारम्बार F876L उत्परिवर्तन हाल ही में इन विट्रो ^3-5 में प्रतिरोधी क्लोन में और क्लिनिक ⁴ में पहले इस उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए इन विवो ⁵ में जेनोग्राफ्ट ट्यूमर में खोज की थी। हाल ही में भंग और उनके सहयोगियों ने कहा कि सबसे कार्यात्मक प्रासंगिक म्यूटेशन सुझाव एक पूर्व मौजूदा उप-जनसंख्या का हिस्सा थे लंबे समय तक दवा प्रदर्शन के दौरान उठता है कि प्रतिरोधी क्लोन की है कि बहुमत दिखाने के लिए दो चिकित्सकीय प्रासंगिक मॉडल में ClonTracer इस्तेमाल किया (2015) ^{11-पूर्व} मौजूदा पहले से ही होने की संभावना है कि चयन ¹¹ के दौरान के लिए चयनित हो जाते हैं।

पहले चर्चा ट्यूमर के जीनोमिक प्रोफाइलिंग के विपरीत, कम विविधता से इस दृष्टिकोण के लाभ 'समरूप' प्रतिरोधी क्लोन संभावित ड्राइवरों की अधिक सटीक आनुवंशिक विच्छेदन को सुविधाजनक बनाने के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। Furthermअयस्क, excitingly, प्रतिरोध के तंत्र को उजागर करने के लिए क्षमता के अलावा, इस विधि को भी इस जानकारी को अज्ञात ¹⁰ है, जिसके लिए बायोएक्टिव छोटे अणुओं के सेलुलर कार्रवाई के तंत्र और लक्ष्यों की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है। स्पष्ट फायदे और इस दृष्टिकोण के कई उपयोगों को देखते हुए, हम यहाँ चिकित्सकीय सार्थक खोजों के लिए क्षमता को अधिकतम करने के लिए इस तरह के एक प्रीक्लीनिकल स्क्रीन के सफल कार्यान्वयन का ब्यौरा एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Protocol

1. ब्याज की यौगिक (एस) के लिए सैनिक 50 का आकलन उचित बोने घनत्व का आकलन करने के लिए ब्याज की सेल लाइनों के लिए विकास की अवस्था (एस) उत्पन्न करता है। बोने के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर सेल नंबर साजिश (दिन 2, 4, 6 और 8) दिन 0. के सापेक्ष यह ब्याज की सेल लाइन के एक रिश्तेदार वृद्धि दर प्रदान करेगा और कहा कि इस तरह के प्रारंभिक बोने घनत्व का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए संगम 7 दिनों के भीतर 96 अच्छी तरह प्लेटों में पूरा नहीं हुआ है। विकास घटता निर्धारित किया गया है एक बार, सेल मीडिया के 100 μl में गैर पारदर्शी, स्पष्ट नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं के बीज उपयुक्त संख्या में सैनिक 50 का आकलन करने के लिए। इस्तेमाल किया और 1.1 में निर्धारित सेल लाइन के आधार पर कोशिकाओं की संख्या बीज। आमतौर पर, 24 घंटा ~ का दोहरीकरण समय, उदा।, HCT116 के साथ तेजी से बढ़ते सेल लाइनों के लिए बीज 3×10 3 कोशिकाओं। एक परख प्लेट (दिन-1) तैयार करें। परख थाली के लिए, संस्कृति मीडिया मैं के 100 μl में वांछित घनत्व में बीज कोशिकाओंn नीले रंग में छायांकित कुओं (चित्रा 1)। वेल्स सफेद में प्रकाश डाला केवल मीडिया में होते हैं। एक नियंत्रण प्लेट (दिन-1) तैयार करें। नियंत्रण थाली के लिए, एक अलग 96 अच्छी तरह से थाली में संस्कृति मीडिया के 100 μl में कदम 1.2.1 में के रूप में कोशिकाओं का एक ही घनत्व बीज। यौगिकों के cytostatic / साइटोटोक्सिक प्रकृति की व्याख्या करने में मदद मिलेगी इस दिवस 0 'पढ़ने (चित्रा 2) का विश्लेषण किया जा रहा है। अगले दिन (0 दिन), नियंत्रण प्लेट पढ़ा। आरटी luminescent सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक (निर्माता के निर्देशों के अनुसार बफर के साथ मिश्रित cellTiter-ग्लो सब्सट्रेट) संतुलित करना और एक समरूप समाधान प्राप्त करने के लिए सामग्री inverting द्वारा धीरे मिश्रण। सेल / मीडिया मिश्रण के 100 μl अभिकर्मक के 80 μl जोड़ें और सेल प्रेरित करने के लिए 30 मिनट के लिए सामग्री को हिला। 560 एनएम का 0.1-1.0 सेकंड और पता लगाने के तरंगदैर्ध्य के एक जोखिम के लिए सेट एक luminometer के साथ रिकॉर्ड luminescence। (यौगिकों परीक्षण यौगिकों जोड़ेंब्याज की) प्लेट (0 दिन) परख करने के लिए। 10 सांद्रता की कुल के लिए 200x अंतिम एकाग्रता में DMSO में यौगिकों के 4 धारावाहिक कमजोर पड़ने (यौगिक और केवल एक DMSO, यौगिक प्लेट युक्त 9 dilutions): एक 1 बनाओ। एक प्रारंभिक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, 0.03 माइक्रोन की 200x सबसे कम खुराक और 2,000 माइक्रोन की शीर्ष खुराक (अंतिम मात्रा 200 μl) के लिए लक्ष्य। 10x अंतिम एकाग्रता (अंतिम मात्रा 100 μl, मध्यवर्ती प्लेट) पर एक यौगिक-मध्यम मिश्रण बनाने के लिए मध्यम करने के लिए क्रमानुसार पतला यौगिकों जोड़ें। परख के दिन 3 पर उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर यौगिक थाली स्टोर। उच्चतम खुराक 10 माइक्रोन (जैसे।, पंक्तियों बी, सी और डी, 0 दिन) (चित्रा 1) ऐसी है कि triplicates में कोशिकाओं को यौगिक-मध्यम मिश्रण के 10 μl जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन के लिए परख प्लेटें सेते हैं। उपयोग के बाद मध्यवर्ती प्लेट (ओं) त्यागें। 3 दिन, 1.4 में तैयार यौगिक प्लेट का उपयोग कर एक 400 μl 1x यौगिक-मध्यम मिश्रण तैयार करें। मीडिया को हटाने और ऑटो पर सूखी थपथपाना परख प्लेटें उलटेंclaved कागज तौलिए 2-3x अवशिष्ट मीडिया को दूर करने के लिए। नीले रंग में छायांकित कुओं के लिए यौगिक / मीडिया (/ अच्छी तरह से 100 μl) जोड़ें और कुओं वाष्पीकरण (चित्रा 1) को रोकने के लिए परिधि करने के लिए मीडिया के 100 μl जोड़ें। एक अतिरिक्त 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर परख प्लेटें पुनः सेते हैं। 6 दिन, 1.3 चरण में वर्णित के रूप में एक चमक पढ़ने के प्रदर्शन से व्यवहार्य कोशिकाओं के सापेक्ष संख्या का आकलन करें। यौगिकों के स्थिर / विषाक्त प्रकृति का आकलन करने के लिए 0 दिन पढ़ने का प्रयोग करें। Cytostatic एजेंटों सेल चक्र गिरफ्तारी के लिए प्रेरित जबकि विषैले एजेंट apoptosis प्रेरित। यौगिक विषैला होता है, तो सैनिक 50, और सैनिक प्रतिरोध assays के लिए 50 एक्स 5 सांद्रता चुनने पर विचार (6 दिन पढ़ने 0 दिन पढ़ने से कम है)। यौगिक ठहराव (D0 पढ़ने के बराबर या अधिक) को प्रेरित करता है हालांकि, अगर सैनिक 100 और प्रतिरोध assays के लिए सैनिक 100 एक्स 5 (चित्रा 2) पर विचार करें। 2. दवा प्रतिरोध Assays स्थापना काम कर बुद्धि तोहा cytostatic एजेंट, प्रतिरोध परख के लिए 150 मिमी 2 टिशू कल्चर व्यंजन (मात्रा = 30 मिलीलीटर) में 30-40% की एक संगम पर बीज कोशिकाओं। एक विषैले एजेंट के साथ काम कर रहे हैं, तो एक 70-80% संगम पर बीज। एक अक्षुण्ण बेमेल मरम्मत (एमएमआर) तंत्र बंदरगाह जो सेल लाइनों के लिए, कदम से कोशिकाओं को सेते कैसरजन एन-इथाइल-एन-nitrosourea के साथ 37 डिग्री सेल्सियस (ENU) पर 2.1 हे / एन। जीनोमिक अस्थिरता को बढ़ाने के लिए 50 मिलीग्राम / एमएल ENU (अंतिम एकाग्रता 50 माइक्रोग्राम / एमएल) के एक शेयर के समाधान के 30 μl के साथ कोशिकाओं को समझो। एक दोषपूर्ण एमएमआर (टेबल्स 2 और 3), ENU या अन्य कार्सिनोजन के साथ इलाज के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है कि सेल लाइनों के लिए। अन्य सेल लाइनों के लिए, माइक्रोसेटेलाइट अस्थिरता 12 का उपयोग कर NCI मापदंडों के आधार पर एमएमआर की कमी का निर्धारण, या माइक्रोसेटेलाइट अस्थिरता assays या एमएमआर जीन 13-15 की Epigenomic / जीनोमिक की रूपरेखा का उपयोग कर प्रकाशित लक्षण वर्णन के आधार पर। परीक्षण परिसर (एस) के साथ इलाज कोशिकाओंएकाग्रता में रुचि कदम 1.8 में निर्धारित की। एक ठेठ तीन दिन की व्यवहार्यता परख 10 में कोशिका मृत्यु का कारण है, जो बेहद जहरीला यौगिकों के लिए, (यानी, सैनिक 50) एक कम खुराक उपचार के साथ शुरू और संवर्द्धित मजबूत तक एकाग्रता परिसर के (सैनिक 50 के गुणकों) हर 2-3 सप्ताह में वृद्धि प्रतिरोध मनाया जाता है। मीडिया की भरपाई होगी और हर 3 डी यौगिक। चयन शुरू किया गया है एक बार प्रतिरोधी क्लोन उभरने, जब तक परिवर्तन मीडिया / यौगिक हर 3-4 दिनों मिश्रण। इलाज कोशिकाओं DMSO के इलाज नियंत्रण कक्षों की तीव्र उपचार के सापेक्ष दवा उपचार के दौरान अधिक से अधिक विकास / व्यवहार्यता दिखाने जब परिभाषा द्वारा प्रतिरोध उभर रहे हैं। 3. सिंगल सेल क्लोन अलग कोशिकाओं की व्यवहार्य समूहों के लिए चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी (बढ़ाई 40x) का उपयोग संस्कृति पकवान की जांच करना। एक अंकन कलम के साथ डिश के तल पर मार्क संतोषजनक क्लोन। औसत आकार के हैं कि क्लोन (बड़ा कालोनियों उठा सकते हैंएकाधिक कोशिकाओं से उत्पन्न) और अच्छी तरह से अन्य कालोनियों से अलग किया। 3.3 कदम में उल्लिखित दो तरीकों में से एक का उपयोग कर क्लोन उठाओ। 1 दृष्टिकोण: एक pipettor का उपयोग (चित्रा 3) विकास मीडिया निकालें और किसी भी अस्थायी कोशिकाओं को हटाने के लिए 1x पीबीएस के साथ कुल्ला। Pipet टिप के साथ 'उठा' क्लोन करने के लिए गाइड के रूप में काले रंग के निशान का उपयोग करें (pipettor से जुड़ा है, P200 अधिमानतः)। 200 μl ताजा मीडिया के साथ 48 अच्छी तरह प्लेटों में स्थानांतरण क्लोन (आधा यौगिक एकाग्रता के साथ कोशिकाओं के इष्टतम वसूली की अनुमति के लिए)। कोशिकाओं 200 μl ताजा मीडिया / आदर्श यौगिक एकाग्रता जोड़ने से पहले 2-3 दिनों के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें। हर 3-4 दिनों मीडिया / यौगिक बदलने के लिए और क्लोन का विस्तार करने के लिए जारी करने के लिए आगे बढ़ें। दृष्टिकोण 2: क्लोनिंग डिस्क का उपयोग (चित्रा 3) 3.2 चरण में वर्णित के रूप में क्लोन के निशान। 5 मिलीलीटर के 0.25% टी युक्त एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान में 3 मिमी क्लोनिंग डिस्क की जगह2 मिनट के लिए rypsin EDTA के। डिश से महाप्राण मीडिया प्रतिरोधी क्लोन युक्त और बाँझ डिस्पोजेबल संदंश का उपयोग ट्रिप्सिन लथपथ क्लोनिंग डिस्क के साथ क्लोन उपरिशायी। क्लोन एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में, प्लेटें लिफ्ट बंद कितनी आसानी के आधार पर, 1-2 मिनट के लिए छोड़ दें। बाँझ संदंश का उपयोग क्लोनिंग डिस्क उठाओ और 200 μl ताजा मीडिया और परिसर के आधे एकाग्रता के साथ 48 अच्छी तरह प्लेटों में हस्तांतरण। पिपेट और नीचे धीरे क्लोनिंग डिस्क से कोशिकाओं को बेदखल और 37 डिग्री सेल्सियस (कुओं में डिस्क क्लोनिंग छोड़) में हे / एन सेते हैं। अगली सुबह, 48 अच्छी तरह प्लेटों से क्लोनिंग डिस्क को हटाने और 200 μl ताजा मीडिया / यौगिक (आधा आदर्श यौगिक एकाग्रता) के साथ कुओं की भरपाई होगी। तीन दिन बाद परिसर के आदर्श एकाग्रता के साथ मीडिया की भरपाई होगी। मीडिया / यौगिक हर 3-4 दिनों बदल सकते हैं और क्लोन का विस्तार करने के लिए जारी करने के लिए आगे बढ़ें। 4. अनुसंधान की डिग्री का आकलनपृथक क्लोन का esistance 10-20 कालोनियों का विस्तार कर रहे हैं एक बार प्रतिरोध की डिग्री का आकलन करने के लिए चरण 1 में वर्णित के रूप में, सैनिक 50 घटता उत्पन्न करते हैं। हमेशा चयन प्रक्रिया के दौरान DMSO के साथ इलाज नियंत्रण आबादी शामिल हैं। यह प्रतिरोध के स्पेक्ट्रम बड़ी होने जा रहा है कि बहुत संभावना है (दूसरों के पूर्ण प्रतिरोध दिखा जबकि कुछ आंशिक दिखा)। दो समूहों के बीच भिन्न हो सकते हैं प्रतिरोध का तंत्र के रूप में इन वर्गों में से प्रत्येक से कुछ ही क्लोन लीजिए। 5. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 15 मिलीलीटर में 2 मिलियन कोशिकाओं (नियंत्रण और प्रतिरोधी क्लोन) (5 मिनट के लिए 500 XG) स्पिन gDNA और आरएनए संग्रह दोनों के लिए शंक्वाकार शीशियों (इसलिए 2 एक्स 2 करोड़ डॉलर)। 1x पीबीएस के साथ दो बार धोने और अलगाव के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस में छर्रों फ्रीज। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार शाही सेना या gDNA अलग करने के लिए एक वाणिज्यिक निकासी किट का प्रयोग करें। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए नमूने जमा करेंविक्रेता के प्रोटोकॉल 10 का उपयोग। 6. जैव सूचना विज्ञान के नमूनों के विश्लेषण (पूरे exome अनुक्रमण) Preprocess एक सबसे अच्छा अभ्यास डीएनए-सेक पाइपलाइन 16 के अनुसार डेटा अनुक्रम। सभी बीडब्ल्यूए 17 का उपयोग मानव जीनोम GRCh37 संदर्भ के लिए पढ़ता मानचित्र। Samtools 18 के साथ संकुचित बेम प्रारूप करने के लिए असम्पीडित सैम स्वरूपित संरेखण कन्वर्ट। क्रमबद्ध संरेखण द्वारा Samtools के साथ समन्वय। पिकार्ड का उपयोग कर पढ़ने समूह जोड़ें। (विशिष्ट बीडब्ल्यूए, Samtools और पिकार्ड आदेशों के लिए, लाइनों, 1-4 पूरक पाठ 1 देखें) मार्क सभी डुप्लिकेट पिकार्ड उपकरण 19 सेट से MarkDuplicates आदेश का उपयोग पढ़ता है। सूचकांक Samtools के साथ इस फाइल। (पूरक पाठ 1, लाइनों 5-6) सब पढ़ता भर में बेमेल ठिकानों को कम से कम करने के लिए, फिर से संगठित करना एक INDEL realigner 20 का उपयोग कर छोटे सम्मिलन या विलोपन शरण क्षेत्रों में स्थानीय स्तर पर पढ़ता है। (पूरक पाठ 1, लाइनों 7-8) आगे accurac सुधार करने के लिएसंस्करण फोन, एक आधार के गुणवत्ता स्कोर recalibration उपकरण का उपयोग कर अनुभव से recalibrate आधार गुणवत्ता स्कोर के वाई। आधार गुणवत्ता अंशांकन उपकरण सही प्रारंभिक गुणवत्ता स्कोर, लेकिन यह भी पढ़ा समूह, मशीन चक्र, आधार स्थिति, और डाईन्यूक्लियोटाइड संदर्भ (+ पिछला वर्तमान कुर्सियां) सहित कई सुविधाओं के खाते covariation में रखना चाहिए ही नहीं। पिकार्ड PrintReads साथ recalibrated बेम उत्पन्न करता है। (इस कदम के लिए विशेष आदेश के लिए, लाइनों, 9-10 पूरक पाठ 1 देखें) दोहराएँ कदम 6.1.1 अनुक्रम प्रत्येक नमूना के लिए (पूरक पाठ 1, लाइनों 1-10) 6.1.4 के माध्यम से। एक बनती संस्करण, 21-23 tool19 बुला का उपयोग कर प्रत्येक क्लोन में एकल nucleotide भिन्नता (SNV) को पहचानें। प्रत्येक क्लोन अनुक्रम के लिए, चलाने बनती संस्करण मिलान "सामान्य" के रूप में माता पिता का क्लोन का उपयोग कर बुला रही है। (पूरक पाठ 1, लाइन 11) आवर्तक, उच्च गुणवत्ता वाले वेरिएंट फिल्टर और एक संस्करण एनोटेशन उपकरण 24 के साथ एनोटेशन के लिए तैयार करते हैं। VA Deprioritizeसभी प्रतिरोधी क्लोन के लिए नहीं आम riants। (पूरक पाठ 2 में आर स्क्रिप्ट देखें) एक एनोटेशन उपकरण 25, 26 के साथ वेरिएंट व्याख्या। कई संस्करण एनोटेशन उपकरण डेटा अपलोड की गई और एक रिमोट सर्वर द्वारा कार्रवाई की जा करने की अनुमति एक साथ वेब एप्लिकेशन है। उच्च कार्यात्मक प्रभाव होने की भविष्यवाणी की उन वेरिएंट को प्राथमिकता के लिए एक कार्यात्मक प्रभाव भविष्यवाणी उपकरण 27-29 का प्रयोग करें। संस्करण एनोटेशन की तरह, कई उपकरण एक वेब इंटरफेस के माध्यम से कार्यात्मक प्रभाव भविष्यवाणी के लिए उपलब्ध हैं।

Representative Results

प्रतिरोध की कुंजी कार्यात्मक ड्राइवरों की खोज के लिए क्षमता को अधिकतम करने के लिए, विस्तार, प्ररूपी परीक्षण और अनुक्रमण के लिए एकल कोशिका क्लोन का चयन करें। चित्रा -4 ए में सचित्र, HCT116 कोशिकाओं उपचार (धराशायी काले हलकों) के दौरान विकसित करने के लिए जारी रखा है कि प्रतिरोधी क्लोन की सहज उद्भव के लिए नेतृत्व साइटोटोक्सिक यौगिक # 1 के साथ एक लम्बी अवधि के लिए इलाज किया। ये क्लोन 1 चित्रा 3 में प्रकाश डाला और बाद में प्ररूपी विश्लेषण के लिए विस्तार किया दृष्टिकोण # का उपयोग कर उठाया गया था। चित्रा 4 बी में दिखाया गया है सभी क्लोन एक असंबंधित साइटोटोक्सिक यौगिक Velcade के प्रति संवेदनशीलता से पता चला है, जबकि, प्रतिरोधी क्लोन 1-3 सभी # 1 यौगिक महत्वपूर्ण प्रतिरोध दिखाया और उसके पास के अनुरूप यौगिक # 2 (अधिक से अधिक व्यवहार्यता / विकास)। प्ररूपी प्रतिरोध की पुष्टि के बाद, gDNA अलग किया गया था और पूरे exome अनुक्रमण विश्लेषण के लिए प्रस्तुत की। जैव सूचना विज्ञान उपकरण उन संरचनात्मक वेरिएंट पर संकीर्ण करने के लिए लागू किया गया है कि1) आवर्तक हैं और 2) कार्यात्मक प्रभाव (चित्रा 5 ए) के लिए क्षमता है। इन दो मानदंडों से मुलाकात की है कि संरचनात्मक वेरिएंट एक स्वतंत्र अनुक्रमण उपकरण के द्वारा पुष्टि की गई। चित्रा 5 ब, पूरे exome अनुक्रमण सेंगर अनुक्रमण विधि का उपयोग कर पुष्टि की थी उपयोग कर पहचाना गया था कि एक विषमयुग्मजी missense उत्परिवर्तन में सचित्र (ऊपरी पैनल, गुम्मट अनुक्रम; कम पैनल, उत्परिवर्ती अनुक्रम)। अनुक्रम पुष्टि के बाद, मूल रूप से प्रतिरोध परख के लिए इस्तेमाल अभिभावकों की सेल लाइन कार्यात्मक उत्परिवर्तन की भूमिका की पुष्टि करने के उत्परिवर्ती सीडीएनए व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर था। चित्रा 6 में सचित्र गुम्मट सीडीएनए की overexpression प्रतिरोध प्रदान करने में विफल रहा है, जबकि, प्रतिरोध के एक ड्राइवर के रूप में इस संरचनात्मक भिन्नता के कार्यात्मक भूमिका की पुष्टि, # 1 यौगिक उत्परिवर्ती सीडीएनए काफी प्रदत्त प्ररूपी प्रतिरोध की अभिव्यक्ति के लिए मजबूर किया। इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल सभी अभिकर्मकों तालिका 1 में रेखांकित कर रहे हैं </s trong>। परख और नियंत्रण प्लेटों के 1. लेआउट चित्रा। ब्लू छाया, यौगिक उपचार कुओं। सफेद छाया, केवल माध्यम है। यौगिकों क्रमानुसार एक पतला कर रहे हैं: 4 और triplicates (बी या ईजी) में प्रशासित रहे हैं। 2 यौगिकों प्रति प्लेट लागू किया जा सकता है। 2. प्रतिनिधि व्यवहार्यता घटता चित्रा। लाल बिंदीदार रेखा 0 दिन पढ़ने। एक्स अक्ष सही और y अक्ष के परिसर की खुराक में वृद्धि का संकेत है DMSO के नियंत्रण कुओं के लिए व्यवहार्यता रिश्तेदार का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिनिधित्व करता है। सैनिक 100% विकास निषेध प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया 100 = खुराक; सैनिक DMSO के नियंत्रण के 50% करने के लिए व्यवहार्यता को कम करने के लिए इस्तेमाल 50 = खुराक। _upload / 52,879 / 52879fig3.jpg "/> चित्रा 3. विस्तार के लिए प्रतिरोधी क्लोन चुनने के लिए दो दृष्टिकोण। दृष्टिकोण 1- उपयोग pipettor लेने के लिए और 48 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए अच्छी तरह से परिभाषित क्लोन हस्तांतरण करने के लिए। दृष्टिकोण 2- उपयोग क्लोन उठा और 48 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए स्थानांतरण करने के लिए क्लोनिंग डिस्क ट्रिप्सिन से लथपथ। इन विट्रो में # 1 यौगिक HCT116 क्लोन के लिए हासिल प्रतिरोध की चित्रा 4. पुष्टिकरण। (ए) यौगिक # 1 प्रतिरोधी HCT116 क्लोन निरंतर तीन सप्ताह के चयन के बाद उभरा। नियंत्रण और प्रतिरोधी क्लोन (बी) व्यवहार्यता विभिन्न यौगिकों के साथ 72 घंटा उपचार के बाद परीक्षण किया गया था। यौगिक # 2 यौगिक # 1 के एक करीबी अनुरूप है। Velcade एक नियंत्रण साइटोटोक्सिक एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। डेटा तीन जैविक प्रतिकृति की औसत + मानक विचलन के रूप में दिखाया गया है। <p class="jove_content" fo:keईपी together.within-पेज = "हमेशा"> यौगिक # 1 प्रतिरोधी HCT116 क्लोन में जीन ए में एक अद्वितीय, आवर्तक उत्परिवर्तन की चित्रा 5. पहचान (एकल nucleotide वेरिएंट, SNVs)। (क) काम प्रवाह सभी प्रतिरोधी क्लोन में मौजूद SNVs की पहचान करने और एक उच्च कार्यात्मक प्रभाव पड़ता है की भविष्यवाणी करने के लिए MutationAssessor द्वारा। सेंगर अनुक्रमण द्वारा जीन ए में उत्परिवर्तन (बी) पुष्टिकरण। उत्परिवर्तित जीन एक प्रदत्त प्रतिरोध की चित्रा 6 पुनः अभिव्यक्ति विट्रो में # 1 यौगिक। इंजीनियर HCT116 सेल लाइनों की व्यवहार्यता यौगिक # 1 के साथ 72 घंटा उपचार के बाद परीक्षण किया गया था। HCT116-गुम्मट या उत्परिवर्ती सेल लाइनों स्थिरतापूर्वक क्रमशः, गुम्मट या जीन की एक उत्परिवर्ती cDNAs व्यक्त कर रहे हैं। डेटा औसत + मानक विचलन ओ के रूप में दिखाया जाता हैतीन जैविक प्रतिकृति च। नमूना नाम एमिनो एसिड प्राथमिक ऊतक युग्मनजता सी-33-ए p.E768fs * 44 गर्भाशय ग्रीवा विषमयुग्मजी सी-33-ए p.S860 * गर्भाशय ग्रीवा विषमयुग्मजी सीएमएल-T1 पी।? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous CP66-एमईएल p.C822F त्वचा विषमयुग्मजी केबल टीवी-1 P.0? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous EFO -27 p.Q130fs * 2 अंडाशय विषमयुग्मजी EFO -27 पी।? अंडाशय विषमयुग्मजी <टीडी> HCC2218 p.E467K स्तन विषमयुग्मजी जम्मू-RT3-T3-5 p.R711 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous LNCaP पी।? प्रोस्टेट Homozygous Lovo पी।? बड़ी आँत Homozygous गिरना-13 p.R711 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous NALM -6 पी।? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous NCI-H630 p.R680 * बड़ी आँत विषमयुग्मजी SKUT -1 p.L787fs * 11 अंतर्गर्भाशयकला Homozygous SKUT -1 बी pL787fs * 11 अंतर्गर्भाशयकला Homozygous समर्थन-T1 पी।? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous तालिका 1 MSH2 -mutated सेल लाइन्स। सेल लाइन (नमूना नाम), अमीनो एसिड प्रतिस्थापन, मूल के वंश और युग्मनजता संकेत कर रहे हैं। नमूना नाम एमिनो एसिड प्राथमिक ऊतक युग्मनजता CCRF-यूके p.R100 * haematopoietic_and_lymphoid_tissue विषमयुग्मजी CCRF-यूके पी।? haematopoietic_and_lymphoid_tissue विषमयुग्मजी सीडब्ल्यू -2 p.Y130fs * 6 बड़ी आँत Homozygous ड्यू-145 पी।? </टीडी> प्रोस्टेट Homozygous जीआर-एसटी पी।? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous HCT-116 p.S252 * बड़ी आँत Homozygous IGROV -1 p.S505fs * 3 अंडाशय Homozygous एम.एन.-60 पी।? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous NCI-SNU -1 p.R226 * पेट Homozygous P30-OHK पी।? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous पीआर-मेल पी।? त्वचा Homozygous REH पी।? haematopoietic_and_lymphoid_tissue </टीडी> Homozygous एसके-ओ वी -3 P.0? अंडाशय Homozygous SNU-1544 p.S2L बड़ी आँत विषमयुग्मजी SNU-1746 p.E523K बड़ी आँत Homozygous SNU-324 p.C233R अग्न्याशय विषमयुग्मजी SNU-324 p.V384D अग्न्याशय विषमयुग्मजी SNU-478 p.V384D अग्न्याशय विषमयुग्मजी तालिका 2 MLH1 -mutated सेल लाइन्स। सेल लाइन (नमूना नाम), अमीनो एसिड प्रतिस्थापन, मूल के वंश और युग्मनजता संकेत कर रहे हैं।

Discussion

सेल लाइन (एस) का चयन: आनुवंशिक राज्य और जीनोमिक अस्थिरता की विशेषता

निस्संदेह, सफलतापूर्वक चिकित्सकीय प्रासंगिक प्रतिरोध तंत्र को उजागर करने में सबसे महत्वपूर्ण कारक प्रारंभिक सेल लाइन चयन है। दो कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, रोग के निर्णायक आनुवंशिक लक्षण शरण इसी वंश / उप प्रकार की सेल लाइन (एस) का चयन करने के लिए लक्ष्य (जैसे।, मेलेनोमा में BRAF ^V600E)। संकेत ^33,34 की एक किस्म के लिए दोनों सेल लाइनों ^30-32 और प्राथमिक / मेटास्टेसिस ट्यूमर के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध transcriptomic और उत्परिवर्तन डेटा से पूछताछ के चयन की प्रक्रिया की सुविधा होगी। चिकित्सकीय प्रासंगिक आनुवंशिक परिवर्तन के साथ सेल लाइनों की पहचान के लिए आदर्श है, कुछ मामलों में इस वजह से इस तरह जांच प्रक्रिया की कठिनाई और लंबाई के रूप में कारकों की वजह से उपलब्ध सेल लाइनों की कमी या संभव करने के लिए संभव नहीं हो सकता है।

<p class="jove_content"ऊपर उल्लिखित बात करने के साथ संबंध है, एक दूसरा पहलू सेल लाइन चयन के दौरान तो विचार करने के लिए> कम या वांछित लाइन का उपयोग स्क्रीनिंग प्रतिरोध की व्यवहार्यता है। उदाहरण के लिए, इस तरह के प्रसार और आंतरिक उत्परिवर्तन दरों के रूप में कारकों बहुत खोज की गति पर प्रभाव कर सकते हैं। यह अंत करने के लिए, सेल लाइनों सहज प्रतिरोध के उद्भव ³⁵ त्वरित किया जा सकता है कि उम्मीद में डीएनए एमएमआर तंत्र में तेजी से विकास कैनेटीक्स और कमी के साथ उपयोग किया जा सकता है। लौकिक डेटाबेस के आधार पर, कई उम्मीदवार सेल लाइनों दो अक्सर उत्परिवर्तित जीन एमएमआर, MSH2 या MLH1 में से एक में कमी के साथ मौजूद हैं (टेबल्स 2 और 3)। ब्याज की सेल लाइनों ऐसे क्षारीकरण एजेंट के रूप में एमएमआर, शारीरिक या डीएनए प्रतिक्रियाशील रासायनिक उत्परिवर्तजन के साथ तीव्र उपचार में असर दोष मौजूद नहीं है, तो वैकल्पिक रूप से, एन -ethyl- एन -nitrosourea (ENU) जीनोमिक अस्थिरता को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि हो सकता है काफी है दोनों दृष्टिकोणप्रतिरोधी क्लोन पाने और अनुवर्ती अनुक्रमण के लिए समय Horten, कड़े कार्यात्मक परीक्षण गैर कार्यात्मक की एक बड़ी संख्या के रूप में उम्मीदवार जीन पर किया जाना चाहिए, यात्री म्यूटेशन उभरने की संभावना है। SNVs कार्यात्मक प्रासंगिक म्यूटेशन की पहचान करने के लिए अवसरों को अधिकतम करने के आदेश दिए रैंक हो सकता है। सबसे पहले, चुनने स्वतंत्र क्लोन में बारम्बार रहे हैं कि उन म्यूटेशन इन म्यूटेशन प्रतिरोध के ड्राइवर हैं संभावना में वृद्धि होगी। घटना में बारम्बार म्यूटेशन दवा की कार्रवाई की व्यवस्था है कि फिट SNVs पर ध्यान केंद्रित, पहचान नहीं कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, दवा लक्ष्य या नशीली दवाओं के लक्ष्य का एक ज्ञात बहाव के प्रेरक) सार्थक हो सकता है। अंत में, सोने के मानक हमेशा दवा के प्रति संवेदनशील पैतृक कोशिकाओं में अस्थानिक सीडीएनए अभिव्यक्ति द्वारा उम्मीदवार SNVs का प्रतिरोध-प्रदान करने गतिविधि की प्रायोगिक मूल्यांकन है।

आरएनए अनुक्रमण बनाम डीएनए

एक बार जब प्रतिरोधी क्लोन उत्पन्न डीएनए और / या आरएनए कर दिया गया हैजरूरत के आधार पर अनुक्रम किया जा सकता। डीएनए अनुक्रमण, exome या पूरे जीनोम अनुक्रमण, या तो इस तरह के SNPs, indels रूप germline और दैहिक वेरिएंट की पहचान की अनुमति और संख्या वेरिएंट कॉपी जाएगा। सृजन ज्ञात कूट क्षेत्रों से पढ़ता है पर अधिक लागत के अनुकूल exome अनुक्रमण केंद्रित है, जबकि पूरे जीनोम अनुक्रमण ऐसे enhancers या miRNAs ³⁶ के रूप में गैर-कोडिंग तत्वों में म्यूटेशन की पहचान की सुविधा हो सकती है, जो पूरे जीनोम के लिए अनुक्रमण डेटा उत्पन्न होगा। जीन अभिव्यक्ति डेटा डीएनए अनुक्रमण के दौरान लगाया नहीं है लेकिन, जब से यह जो उत्परिवर्तन (एस) एक कार्यात्मक ड्राइवर होने की संभावना है भविष्यवाणी करना मुश्किल है। इस संबंध में शाही सेना के अनुक्रमण, हालांकि अधिक महंगा है, यह लाभ प्रदान करता है। उत्परिवर्तन बुला ही व्यक्त आरएनए प्रजातियों पर किया जाता है कि इस तथ्य के हित के उत्परिवर्तन एक कार्यात्मक चालक हो सकता है कि संभावना को बढ़ाता है। अनुवर्ती कार्यात्मक परीक्षण भी आरएनए अनुक्रमण के लिए परिवर्तन का एक और अधिक ध्यान केंद्रित सर्वेक्षण अनुमति के अलावायह भी प्रतिरोध के रूप में शक्तिशाली ड्राइवरों सेवा कर सकते हैं कि जीन fusions सहित जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन, वैकल्पिक splicing और उपन्यास कैमेरिक आरएनए प्रजातियों की पहचान करने में सक्षम होने का जोड़ा लाभ प्रदान करता है।

जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन

उदाहरण कमांड चित्रण प्रयोजनों के लिए प्रदान की जाती हैं, लेकिन अधिक विस्तृत दस्तावेज और ट्यूटोरियल संस्थान ¹⁶ ब्रॉड से उपलब्ध हैं और NGS विश्लेषण शुरू करने से पहले अच्छी तरह से पढ़ा जाना चाहिए। निम्न आदेशों के सभी उपकरण और संदर्भ डेटा पूर्व स्थापित कर दिया गया है, जिस पर एक प्रणाली पर एक यूनिक्स खोल पर्यावरण के लिए तैयार कर रहे हैं। ये आदेश भी FASTQ फाइलों से युक्त बनती अंत अनुक्रम "माता पिता" और "प्रतिरोधी," विक्रेता से प्राप्त हुआ है और "डेटा" निर्देशिका में रखा गया है का नाम है, दो नमूने से पढ़ता मान। ज्यादातर मामलों में इन आदेशों अनुकूलित किया जाना चाहिए या अतिरिक्त कमांड लाइन ARG का उपयोग कर एक विशेष आवेदन के लिए अनुकूलितuments (जैसे, बीडब्ल्यूए कमांड को "आयकर 8" जोड़ने 8 CPU कोर भर थ्रेड आपरेशन अनुमति देता है)। बेम फ़ाइल में केवल एक नमूना कुछ उपकरण के लिए फ़ाइल स्वरूप आवश्यकताओं के साथ पालन करने के लिए, भले ही वहाँ (जैविक नमूने के संरेखण के लिए आवंटित है) पढ़ें समूहों, अक्सर बेम फाइल करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए। समूह के मापदंडों RGID, RGSM, RGPL, RGPU पढ़ें, और RGLB मनमाना नमूना नाम का वर्णन तार, अनुक्रमण मंच, और पुस्तकालय रणनीति हो सकती है।

इन विवो assays बनाम विट्रो में

इन विट्रो चयन द्वारा की पहचान कई प्रतिरोध तंत्र चिकित्सकीय प्रासंगिक हो सत्यापित किया गया है, तंत्र नैदानिक ​​प्रतिरोध के रूप में प्रासंगिक या प्रमुख तंत्र की सेवा नहीं कर सकता है कि वहाँ एक संभावना मौजूद है। इसका एक कारण यह उपचार के लिए प्रतिरोध ड्राइविंग में सूक्ष्म वातावरण के लिए एक आवश्यक भूमिका, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल / सेटअप डी में रहित है कि एक घटक शामिल हो सकते हैंइस प्रकार अब तक iscussed। दरअसल, कई अध्ययनों ट्यूमर कोशिकाओं स्ट्रोमा ^37,38 द्वारा प्रदत्त प्रतिरोध की जन्मजात तंत्र जिसका अर्थ stromal कोशिकाओं की उपस्थिति में सुसंस्कृत हैं जब ट्यूमर कोशिकाओं को मारने में सक्षम हैं कि विरोधी कैंसर एजेंटों अप्रभावी प्रदान कर रहे हैं कि पता चला है। ऐसे स्ट्रोमा प्रेरित अधिग्रहण प्रतिरोध तंत्र की पहचान करने के लिए, एक में इन विट्रो सह संस्कृति या विवो ट्यूमर प्रतिरोध assays में प्रदर्शन कर विचार कर सकते हैं। पूर्व परख काफी जटिल है, कई प्रतिरोध ड्राइविंग में स्ट्रोमा की संभावित भूमिका का पता करने के लिए दवा प्रतिरोधी ट्यूमर xenografts पैदा करने के लिए सहारा है। इस तरह के अध्ययन स्ट्रोमा वास्तव में उत्तरार्द्ध में एक भूमिका निभा सकते हैं जिसका अर्थ है कि इन विट्रो चयन करने के लिए प्रतिरोध रिश्तेदार के दोनों समान ⁵ और अद्वितीय ³⁹ तंत्र का पर्दाफाश किया है। हालांकि, एक यह एक ऐसी प्रतिरोधी ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए लग सकता है समय की लंबाई और अनुवर्ती जीनोमिक विश्लेषण-complexitie की जटिलता के प्रति जागरूक होना चाहिएइंट्रा-tumoral आणविक और सेलुलर विविधता के कारण है।

लक्ष्य की पहचान

दवा प्रतिरोध तंत्र को उजागर करने के लिए इसके अलावा, इस NGS आधारित जीनोमिक रूपरेखा के दृष्टिकोण को भी रासायनिक जांच के सेलुलर लक्ष्यों की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है। ऐतिहासिक दृष्टि से, कई निष्पक्ष तरीकों मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के साथ युग्मित आत्मीयता शुद्धि, खमीर जीनोमिक तरीकों, आरएनएआई स्क्रीनिंग, और कम्प्यूटेशनल निष्कर्ष ⁴⁰ दृष्टिकोण सहित जैविक गतिविधियों के साथ कम आणविक वजन रसायनों के सेलुलर कार्रवाई के तंत्र और लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यौगिकों के कार्यात्मक सेलुलर लक्ष्य में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं प्रतिरोध है कि सक्षम phenotypically प्रतिरोधी सेल आबादी, अद्वितीय आवर्तक एकल nucleotide बदलाव (SNVs) या अभिव्यक्ति परिवर्तन की पहचान की NGS आधारित जीनोमिक या transcriptomic की रूपरेखा का उपयोग कर दवा प्रतिरोध तंत्र की व्याख्या करने के लिए एक विस्तार के रूप में। टीउसकी मनाया प्रतिरोध तंत्र की एक सबसेट छोटे अणु के प्रत्यक्ष प्रोटीन लक्ष्य सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि जीन में म्यूटेशन आवर्तक शामिल हो सकता है कि इस विचार पर आधारित है। हाल ही में, कई रिपोर्टों विशेष रूप से ^9,10 जांच छोटे अणु की सेलुलर लक्ष्य का खुलासा करने के लिए बड़े पैमाने पर कैंसर कोशिका लाइन संवेदनशीलता रूपरेखा सहित अन्य तरीकों के साथ संयोजन के द्वारा, दृष्टिकोण की उपयोगिता मान्य।

Materials

48-well plates	Fisher Scientific	07-200-86	Expanding clones
96-well plates	Fisher Scientific	07-200-588	Generating GI50 curves
CellTiter-Glo	Promega	G7572	Viability testing
Cloning discs (3 mm)	Sigma	Z374431	Picking clones
Sterile forceps	Unomedical	DF8088S	Picking clones
RNeasy Plus RNA extraction kit	Qiagen	74134	Isolating RNA
Blood and Tissue DNeasy extraction kit	Qiagen	69581	Isolating gDNA
GATK	The Broad Institute		Indel realigner
MuTect	The Broad Institute		Paired variant calling tool
Oncotator	The Broad Institute		Variant annotation tool
MutationAccessor	The Broad Institute		Functional impact prediction tool