Реализация<em> In Vitro</em> Лекарственной устойчивости Анализы: Максимизация потенциала для раскрытия клинически значимых механизмов сопротивления

Summary

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance–prior to or following clinical onset–is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Abstract

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Introduction

Подробное молекулярная характеристика опухолевых геномов по надежных технологий секвенирования и улучшение данных аналитических инструментов привело к открытию ключевых генетических изменений в конкретных видах рака ^1,2. Разработка целевых методов лечения, направленных на этих генетических поражений, таких как HER2, BCR-ABL, EGFR и ALK, значительно улучшили качество жизни пациентов ^1,2. Тем не менее, несмотря на специфичность этого подхода, клинический ответ на большинстве одиночных лечения была неоптимальной, как сопротивление, в конечном счете возникает. Недавно значительный прогресс был достигнут в понимании молекулярных основ в устойчивости целевых терапии. Интересно, это становится очевидным, что видный механизм сопротивления включает в себя постоянную цель / активность пути. В случае в точке, андроген рецептор (АР) -directed enzalutamide лечение рака простаты приводит к обогащению активирующих мутаций в самой AR, поддерживая АР сигнализации OUTPут в присутствии ингибитора ^3-5. Это знание привело к агрессивной кампании: 1) разработать антагонисты третьего поколения, которые могут продолжать подавлять как WT и функцию мутантного-AR в enzalutamide устойчивостью РПЖ ^{3 и} 2) определить потенциальные вниз по течению узлы АР сигнализации, которые могут быть направлены для терапевтического вмешательства , Аналогично, устойчивость к другим классам ингибиторов, таких как меры, нацеленные на EGFR, BRAF и ABL часто приводят к мутациям, что оживлению оригинальный употреблению киназы ^1.

С осознанием того, что сопротивление неизбежно возникает у большинства пациентов, разработке подходов к оперативно довести эти механизмы на свет позволит развитие эффективной последующей терапии. Один подход, который широко используется для анализа геномики клинических резистентных опухолей по отношению к лечебно-наивных или, чувствительными опухолями по выявлению обогащения / истощения в генетических поражений, которые могут быть поддаются DОткрытие ковер. Несмотря на обещания, есть две основные обязательства такого подхода, которые препятствуют быстро открытие. Во-первых, получение своевременного доступа к опухолевого материала для геномной допроса может служить значительным препятствием в переходе от терапии для лечения. Во-вторых, деконволюции множества генетических поражений в устойчивой обстановке может быть сложным, так как опухоли могут представить существенные внутригрупповые опухолевый неоднородность ^6,7.

В свете этих проблем, там был увеличен на доклинической зависимость открытия механизмов сопротивления. Этот подход может позволить идентификацию известных механизмов резистентности до клинических испытаний ^1, которые могут направлять альтернативные стратегии клинической управления в тех пациентов, которые имеют эти механизмы либо до терапии или следующие начала сопротивления.

Одним из таких инструментов доклинические открытие, что в настоящее время широко используется, чтобы применить объективные функциональные экраны RNAi. Для экзаменаPLE, Уиттакер и его коллеги применили геном масштаба экрана RNAi, чтобы идентифицировать, что потеря НФ1 посредником сопротивление ВВС и MEK ингибиторов на основе устойчивого МАРК активации пути ^8. Эти данные были найдены, чтобы быть клинически значимыми, как с потерей функции мутации в NF1 наблюдались в BRAF -mutant опухолевых клеток, которые неразрывно устойчивы к RAF торможения и в опухолях меланомы, устойчивых к Vemurafenib активации ^8. Тем не менее, несмотря на успех такого подхода, многие клинически значимых целей, часто не определены, предположительно из-за потери от-функции смещения этого подхода.

В противоположность этому, менее предвзято инструмент для доклинической открытия механизмов резистентности включает в себя генерацию клеточных линий, устойчивых при длительном воздействии интерес соединения в сочетании с NGS основе геномной или транскриптомных профилирования. Этот подход был успешно реализован в несколько групп, чтобы определить спонтанноерецидивирующие одиночные варианты нуклеотид или выражение изменения, которые позволяют сопротивление ^5,9,10. Например, рецидивирующий F876L мутация в АР было недавно обнаружено в устойчивых клонов в пробирке ^3-5 и ксенотрансплантатов опухолей в естественных условиях ⁵ до идентификации этой мутации в клинике ^4. Совсем недавно, гашиш и его коллеги ⁽²⁰¹⁵⁾ 11, используемый ClonTracer в двух клинически значимых моделей, чтобы показать, что большинство устойчивых клонов, которые возникают при длительном воздействии наркотиков были частью уже существующей субпопуляции предположить, что наиболее функционально отношение мутации, скорее всего, уже существовавших ранее которые становятся выбраны для при выборе ^11.

В отличие от геномной профилирования опухолей, обсуждаемых ранее, этот подход выгоды от менее неоднородности как "гомогенные" резистентные клоны используются для анализа содействия более точное генетическое рассечение потенциальных водителей. Furthermруда, возбуждающе, в дополнение к возможности для выявления механизмов резистентности, этот метод может также применяться для идентификации клеточных механизмов действия и целевые биоактивных малых молекул, для которых эта информация неизвестна ^10. Учитывая явные преимущества и многократное использование этого подхода, здесь мы приводим протокол с подробным успешной реализации такого доклинических экране, чтобы максимизировать потенциал для клинически значимых открытий.

Protocol

1. Оценка GI 50 для соединения (ы), представляющие интерес Генерирование кривой (ы) для роста клеточных линий, представляющих интерес для оценки соответствующей плотности посева. Сюжет количества клеток в различные моменты времени следующей посева (дни 2, 4, 6 и 8) по отношению к 0 день Это обеспечит относительную скорость роста клеточной линии интересов и должны быть использованы для оценки начальной плотности посева такая, что Стечение не достиг в 96-луночных планшетах в течение 7 дней. После кривые роста были определены, семена соответствующее количество клеток в непрозрачных, прозрачным дном 96-луночных планшетах в 100 мкл клеточных сред для оценки GI 50. Семенной количество элементов на основе клеточной линии, используемой и определяемую в 1,1. Как правило, семена 3х10 3 клеток для клеточных линий быстрорастущих с удвоением-времени ~ 24 ч., Например, НСТ116. Подготовка планшета для анализа (день-1). Для аналитического планшета, семенные клетки в нужной плотности в 100 мкл культуральной среды Iн скважин, окрашенные в синий (рисунок 1). Уэллс выделены белым содержать только средства массовой информации. Подготовка контрольной чашке (день-1). Для контрольной чашке, семена ту же плотность клеток, как на стадии 1.2.1 в 100 мкл культуральной среды в отдельном 96-луночном планшете. Это "день 0" чтение поможет в интерпретации цитостатическое / цитотоксическое характер соединений анализируются (рисунок 2). На следующий день (день 0), прочитать управления пластину. Равновесие люминесцентные жизнеспособность клеток реагента (Celltiter-Glo субстрат, смешанный с буфером соответствии с инструкциями изготовителя) до комнатной температуры и аккуратно перемешать путем обращения содержимое, чтобы получить гомогенный раствор. Добавить 80 мкл реагента для 100 мкл клеток / медиа микс и встряхните содержимое в течение 30 мин, чтобы вызвать лизис клеток. Запись люминесценции с установленным на фотометре выдержкой 0,1-1,0 сек и обнаружения длины волны 560 нм. Добавить тестируемых соединений (соединенийинтерес) для анализа пластин (день 0). Выполнить 1: 4 серийное разведение соединений в ДМСО 200x конечной концентрации в общей сложности 10 концентрациях (9 разведений, содержащих соединение и один только ДМСО, соединение пластин). В качестве исходного отправной точки, стремиться к 200x низкой дозе 0,03 мкм и верхний дозе 2,000 мкм (конечный объем 200 мкл). Добавить серийно разбавленных соединений в среде для получения соединения среднего смеси при конечной концентрации 10-кратным (конечный объем 100 мкл, промежуточная пластина). Хранить соединение пластины при -20 ° С для использования на 3-й день анализа. Добавить 10 мкл соединения среднего смеси с клетками в трех экземплярах, таких, что высокая доза составляет 10 мкм (например., Ряды B, C и D, день 0) (Рисунок 1). Инкубируют планшеты для анализа в течение 3 дней при 37 ° С. Откажитесь промежуточную пластину (ы) после использования. На 3 день, подготовить 400 мкл 1x соединение среднего смесь с использованием соединения пластинок, полученных в 1.4. Обратить Планшеты удалить средства массовой информации и высушите на автоclaved бумажные полотенца 2-3x, чтобы удалить остатки средств массовой информации. Добавить соединение / средства массовой информации (100 мкл / лунку) в лунки затененных синим и добавить 100 мкл СМИ периметру скважины, чтобы предотвратить испарение (рисунок 1). Повторное инкубировать планшеты для анализа при 37 ° С в течение дополнительных 3 дней. На 6 день оценки относительного числа жизнеспособных клеток, выполняя считывание люминесценции, как описано в шаге 1.3. Используйте день 0 чтение для оценки статической / токсический характер соединений. Токсичные агенты индуцировать апоптоз, тогда как цитостатики вызвать остановку клеточного цикла. Если соединение является токсичным (день 6 чтение ниже день 0 чтения), рассмотрим выборе Г.И. 50 и GI 50 х 5 концентрации для сопротивления анализов. Тем не менее, если соединение вызывает застой (равный или более высокий, чем d0 чтения), рассмотрим GI 100 GI 100 и x5 для сопротивления анализов (рисунок 2). 2. Настройка лекарственной устойчивости Анализы Если рабочий остроумиега цитостатик, семена клетки при впадении 30-40% в 150 мм 2 ткани культуры блюд (объем = 30 мл) для сопротивления анализе. При работе с токсическим агентом, семена на 70-80% слияния. Для клеточных линий, которые несут интактный несоответствие ремонт (MMR) механизм, инкубировать клетки с шага 2,1 O / N при 37 ° С с канцерогена N-этил-N-нитрозомочевины (ЕНУ). Treat клеток 30 мкл исходного раствора 50 мг / мл ЕНУ (конечная концентрация 50 мкг / мл), чтобы повысить нестабильность генома. Для клеточных линий, которые имеют дефектные MMR (таблицы 2 и 3), лечение с ЕНУ или других канцерогенов не может быть необходимым. Для других клеточных линий, определить MMR-дефицитной по критериям NCI использованием микросателлитных нестабильности 12, или на основе опубликованной характеристики с использованием микросателлитных анализов нестабильность или геномной / эпигеномном профилирование MMR генов 13-15. Treat клетки с тестируемым соединением (ами)проценты по концентрации определяется на этапе 1.8. Для высокотоксичных соединений, которые вызывают гибель клеток в типичном трехдневного жизнеспособность анализа 10, начать с лечения низкими дозами (т.е., Г.И. 50) и постепенно увеличивайте концентрацию (кратные GI 50) соединения каждые 2-3 недели, пока надежные сопротивление наблюдается. Пополнять средства массовой информации и соединение каждый 3 D. После того, как выбор был инициирован, изменение средств массовой информации / соединение смешать каждые 3-4 дня, пока резистентные клоны не появляются. Сопротивление по определению возникает тогда, когда обработанные клетки показывают больший рост / жизнеспособность во время лечения наркотиками относительно лечения острого контрольных клеток ДМСО обращению. 3. Изоляция одну ячейку клоны Исследуйте культуры блюдо использованием фазово-контрастной микроскопии (увеличение 40х) для жизнеспособных кластеров клеток. Все удовлетворительные клоны в нижней части блюдо с маркером. Выберите клонов, которые имеют средний размер (большие колонии могутпроисходят из нескольких ячеек) и хорошо изолированы от других колоний. Выберите клонов, используя один из двух подходов, изложенных в пункте 3.3. Подход 1: Использование пипетки (рис 3) Удалить СМИ роста и промыть 1x PBS, чтобы удалить любые плавающие клетки. Используйте черные метки в качестве руководства к «собирание» клонов с пипетки наконечник (прилагается к пипетки, p200 предпочтительно). Передача клонов в 48-луночных планшетах с 200 мкл свежей среды (с половинной концентрации соединения, чтобы позволить оптимальное восстановление клеток). Разрешить клетки для восстановления в течение 2-3 дней, прежде чем добавлять в 200 мкл свежей среды / идеально концентрации соединение. Продолжить, чтобы изменить медиа / соединение каждые 3-4 дня и впредь расширять клонов. Подход 2: Использование клонирования дисков (Рисунок 3) Отметить клонов, как описано в шаге 3.2. Поместите 3 мм клонирования дисков в 10 см блюдо культуры ткани, содержащей 5 мл 0,25% Trypsin-ЭДТА в течение 2 мин. Аспирируйте средств массовой информации из блюдо, содержащее устойчивые клоны и накладывать клонов с трипсина пропитанной клонирования дисков с использованием стерильных одноразовых щипцы. Оставьте на 1-2 мин, в зависимости от того, как легко клоны поднимите пластины, в 37 ° C инкубатора. Возьмите клонирования дисков, используя стерильного пинцета и передачи в 48-луночных планшетах с 200 мкл свежей среды и половинной концентрации соединения. Внесите вверх и вниз, осторожно, чтобы выбить клеток клонирования дисков и инкубировать O / N при 37 ° C (оставить клонирования дисков в скважинах). На следующее утро, удалить клонирования дисков от 48-луночных планшетах и ​​пополнить скважин с 200 мкл свежей СМИ / соединения (половина идеальным концентрации соединение). Три дня спустя, пополнить СМИ с идеальной концентрации соединения. Продолжить, чтобы изменить СМИ / соединение каждые 3-4 дня и впредь расширять клонов. 4. Оценка Степень Resistance из выделенных клонов После 10-20 колонии расширен, генерировать GI 50 кривые, как описано в шаге 1, чтобы оценить степень устойчивости. Всегда включайте населения управления обработанные ДМСО в процессе отбора. Это очень вероятно, что спектр сопротивления будет большим (некоторые показывая частичное то время как другие, показывая полный сопротивление). Собрать несколько клонов из каждого из этих классов, как механизм резистентности может варьировать между двумя группами. 5. Следующее поколение Секвенирование Спин вниз 2 миллионов клеток (контроль и устойчивых клонов) (500 мкг в течение 5 мин) в 15 мл конические пробирки для обоих гДНК и сбора РНК (поэтому 2 х 2000000). Дважды промывали PBS и 1x заморозить гранул в -80 ° С до готовности для изоляции. Использование коммерческих набора для экстракции для выделения РНК или GDNA в соответствии с протоколом производителя. Отправить образцы для следующего поколения секвенированияс использованием протокола поставщика 10. 6. Биоинформатика анализ проб (вся-секвенирование экзома) Предварительная обработка последовательности данных в соответствии с лучшей практикой ДНК-след трубопровода 16. Карта всего читает референсный геном человека, используя GRCh37 BWA 17. Преобразование несжатых SAM отформатированные выравнивания в сжатом формате БАМ с Samtools 18. Сортировать по координации выравнивания с Samtools. Добавить чтения группы, используя Пикар. (Для конкретных ВСБ, Samtools и Пикард команды, смотрите дополнительную текст 1, линии 1-4) Отметить все дубликаты читает помощью команды MarkDuplicates от инструментом Пикард установить 19. Список этот файл с Samtools. (Дополнительный текст 1, строки 5-6) Чтобы свести к минимуму несоответствие базы по всем читает, читает перестроить локально в областях, несущих небольшие вставки или удаления, используя INDEL realigner 20. (Дополнительный текст 1, строки 7-8) Для дальнейшего улучшения accuracу варианта призвания, эмпирически Recalibrate оценки качества базы с использованием базы качественный инструмент оценка калибровки. Инструмент калибровки база качества должны не только правильно начальная оценка качества, но также принимать во внимание ковариации несколько функций, в том числе чтения группы, машинный цикл, базовой позиции и контекста динуклеотида (предыдущие + текущие баз). Создание перекалиброванной БАМ с Пикара PrintReads. (Для определенных команд для этого шага, см Дополнительный текст 1, линии 9-10) Повторите шаги 6.1.1 через 6.1.4 (Дополнительный текст 1, строки 1-10) для каждого образца. Секвенированной Определить единый вариант нуклеотидной (СНВ) в каждом клоне с использованием парных вариант вызова tool19, 21-23. Для каждого клона секвенировали, запустите в паре вариант вызова с помощью родительского клона как согласованный "нормально". (Дополнительный текст 1, строка 11) Фильтр текущие, варианты высокого качества и готовиться к аннотации с аннотаций вариант инструмента 24. Исключение из числа приоритетных ваriants не на всех устойчивых клонов. (См R сценарий в дополнительном текст 2) Авторство варианты с аннотаций инструмента 25, 26. Многие инструменты вариант аннотации имеют сопроводительную веб-приложение, позволяющее данные будут загружены и обработаны с помощью удаленного сервера. Используйте функциональный инструмент прогнозирования воздействия 27-29 приоритеты те варианты, предсказанные того высокую функциональную среду. Как вариант аннотации, несколько инструменты доступны для прогнозирования функционального воздействия через веб-интерфейс.

Representative Results

To maximize the potential for discovering key functional drivers of resistance, select single cell clones for expansion, phenotypic testing and sequencing. As illustrated in Figure 4A, HCT116 cells treated for a prolonged period with cytotoxic compound #1 led to the spontaneous emergence of resistant clones that continued to grow during treatment (dashed black circles). These clones were picked using approach #1 highlighted in Figure 3 and subsequently expanded for phenotypic analysis. As shown in Figure 4B, resistant clones 1-3 all showed significant resistance to compound #1 and its close analog compound #2 (greater viability/growth), whereas all clones showed sensitivity to an unrelated cytotoxic compound velcade. Following confirmation of phenotypic resistance, gDNA was isolated and submitted for whole-exome sequencing analysis. Bioinformatics tools were applied to narrow in on those structural variants that are 1) recurrent and 2) have the potential for functional impact (Figure 5A). Structural variants that met these two criteria were confirmed by an independent sequencing tool. As illustrated in Figure 5B, a heterozygous missense mutation that was identified using whole-exome sequencing was confirmed using the Sanger sequencing method (upper panel, WT sequence; lower panel, mutant sequence). Following sequence confirmation, the parental cell line originally used for the resistance assay was genetically engineered to express the mutant cDNA to functionally confirm the role of the mutation. As illustrated in Figure 6, whereas overexpression of the WT cDNA failed to confer resistance, forced expression of the mutant cDNA significantly conferred phenotypic resistance to compound #1, confirming the functional role of this structural variation as a driver of resistance. All reagents used for this experiment are outlined in Table 1. Figure 1. Layout of assay and control plates. Blue shade, compound treatment wells. White shade, medium only. Compounds are serially diluted 1:4 and are administered in triplicates (B-D or E-G). 2 compounds can be applied per plate. Figure 2. Representative viability curves. Red dotted line represents the day 0 reading. x-axis indicates increasing doses of compound to the right and y-axis represents viability relative to DMSO control wells. GI100= dose used to achieve 100% growth inhibition; GI50= dose used to reduce viability to 50% of DMSO control. Figure 3. Two approaches for picking resistant clones for expansion. Approach 1- use pipettor to pick up and transfer well-defined clones to 48-well plates. Approach 2- use trypsin-soaked cloning discs to lift clones and transfer to 48-well plates. Figure 4. Confirmation of the resistance achieved for HCT116 clones to compound #1 in vitro. (A) Compound #1-resistant HCT116 clones emerged following continuous three-week selection. (B) Viability of control and resistant clones was tested after 72 hr treatment with various compounds. Compound #2 is a close analog of compound #1. Velcade was used as a control cytotoxic agent. Data are shown as average + standard deviation of three biological replicates. Figure 5. Identification of a unique, recurrent mutation (single nucleotide variants, SNVs) in gene A in compound #1-resistant HCT116 clones. (A) Work flow to identify SNVs present in all resistant clones and predicted to have a high functional impact by MutationAssessor. (B) Confirmation of the mutation in gene A by Sanger Sequencing. Figure 6. Re-expression of mutated gene A conferred resistance to compound #1 in vitro. Viability of the engineered HCT116 cell lines was tested after 72 hr treatment with compound #1. HCT116-WT or mutant cell lines are stably expressing WT or mutant cDNAs of gene A, respectively. Data are shown as average + standard deviation of three biological replicates. Sample Name Amino Acid Primary Tissue Zygosity C-33-A p.E768fs*44 cervix Heterozygous C-33-A p.S860* cervix Heterozygous CML-T1 p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous CP66-MEL p.C822F skin Heterozygous CTV-1 p.0? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous EFO-27 p.Q130fs*2 ovary Heterozygous EFO-27 p.? ovary Heterozygous HCC2218 p.E467K breast Heterozygous J-RT3-T3-5 p.R711* haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous LNCaP p.? prostate Homozygous LoVo p.? large_intestine Homozygous MOLT-13 p.R711* haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous NALM-6 p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous NCI-H630 p.R680* large_intestine Heterozygous SKUT-1 p.L787fs*11 endometrium Homozygous SKUT-1B p.L787fs*11 endometrium Homozygous SUP-T1 p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous Table 1. MSH2-mutated Cell Lines. Cell line (sample name), amino acid substitution, the lineage of origin and the zygosity are indicated. Sample Name Amino Acid Primary Tissue Zygosity CCRF-CEM p.R100* haematopoietic_and_lymphoid_tissue Heterozygous CCRF-CEM p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Heterozygous CW-2 p.Y130fs*6 large_intestine Homozygous DU-145 p.? prostate Homozygous GR-ST p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous HCT-116 p.S252* large_intestine Homozygous IGROV-1 p.S505fs*3 ovary Homozygous MN-60 p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous NCI-SNU-1 p.R226* stomach Homozygous P30-OHK p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous PR-Mel p.? skin Homozygous REH p.? haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygous SK-OV-3 p.0? ovary Homozygous SNU-1544 p.S2L large_intestine Heterozygous SNU-1746 p.E523K large_intestine Homozygous SNU-324 p.C233R pancreas Heterozygous SNU-324 p.V384D pancreas Heterozygous SNU-478 p.V384D pancreas Heterozygous Table 2. MLH1-mutated Cell Lines. Cell line (sample name), amino acid substitution, the lineage of origin and the zygosity are indicated.

Discussion

Selection of cell line(s): Characterization of genetic state and genomic instability

Undoubtedly, the single most critical factor in successfully uncovering clinically relevant resistance mechanisms is the initial cell line selection. Two factors should be considered. First, aim to select cell line(s) of the same lineage/subtype harboring the defining genetic traits of the disease (e.g., BRAF^V600E in melanoma). Interrogation of publically available transcriptomic and mutation data for both cell lines^30-32 and primary/metastasis tumors for a variety of indications^33,34 will facilitate the selection process. Although identification of cell lines with clinically relevant genetic alterations is ideal, in some instances this may not be possible due to lack of available cell lines or feasible due to factors such as difficulty and length of the screening process.

With regards to the aforementioned point, a second factor to consider then during cell line selection is the ease or feasibility of resistance screening using the desired line. For example, factors such as proliferation and intrinsic mutation rates can greatly impact on the speed of discovery. To this end, cell lines can be utilized with faster growth kinetics and deficient in DNA MMR mechanisms in the hopes that emergence of spontaneous resistance can be accelerated³⁵. Based on the COSMIC database, several candidate cell lines exist with deficiency in one of two frequently mutated MMR genes, MSH2 or MLH1 (Tables 2 and 3). Alternatively, if cell lines of interest do not exist bearing defects in MMR, acute treatment with physical or DNA reactive chemical mutagens such as the alkylating agent N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) can be used to enhance genomic instability. Although both approaches may significantly shorten the time to attain resistant clones and follow-up sequencing, stringent functional testing should be performed on candidate genes as a greater number of non-functional, passenger mutations are likely to emerge. SNVs can be rank ordered to maximize chances for identifying functionally relevant mutations. Firstly, choosing those mutations that are recurrent in independent clones will increase the likelihood these mutations are drivers of resistance. In the event recurrent mutations are not identified, focusing on SNVs that fit the mechanism of action of the drug (for example, the drug target or a known downstream effector of the drug target) may be meaningful. Ultimately, the gold standard is always experimental evaluation of resistance-conferring activity of the candidate SNVs by ectopic cDNA expression in drug-sensitive parental cells.

DNA vs RNA sequencing

Once resistant clones have been generated, DNA and/or RNA can be sequenced depending on the need. DNA sequencing, either exome or whole-genome sequencing, will allow identification of germline and somatic variants, such as SNPs, indels and copy number variants. Whereas the more cost-friendly exome sequencing focuses on generating reads from known coding regions, whole-genome sequencing will generate sequencing data for the entire genome which may facilitate identification of mutations in non-coding elements such as enhancers or miRNAs³⁶. However, since gene expression data is not gauged during DNA sequencing, it is difficult to predict which mutation(s) is likely to be a functional driver. In this regard, sequencing of RNA, although more costly, offers this advantage. The fact that mutation calling is only performed on expressed RNA species enhances the likelihood that the mutation of interest may be a functional driver. In addition to allowing a more focused survey of mutations for follow-up functional testing, RNA sequencing also offers the added advantage of being able to identify gene expression alterations, alternative splicing and novel chimeric RNA species, including gene fusions that may also serve as potent drivers of resistance.

Bioinformatics pipeline

Example commands are provided for illustration purposes, but more detailed documentation and tutorials are available from the Broad Institute¹⁶ and should be read thoroughly before beginning NGS analysis. The following commands are designed for a UNIX shell environment on a system on which all tools and reference data have been pre-installed. These commands also assume FASTQ files containing paired-end sequence reads from two samples, named "parental" and "resistant," have been received from the vendor and placed in the "data" directory. In most cases these commands should be adapted or optimized for a specific application using additional command-line arguments (e.g., adding "-t 8" to the bwa command allows multithreaded operation across 8 CPU cores). Read groups (which assign alignments to biological samples), must often be added to BAM files even if there is only one sample per bam file, in order to comply with file format requirements for certain tools. Read group parameters RGID, RGSM, RGPL, RGPU, and RGLB can be arbitrary strings describing the sample name, sequencing platform, and library strategy.

In vitro vs in vivo assays

Although several resistance mechanisms identified by in vitro selection have been verified to be clinically relevant, there exists a possibility that the mechanisms may not serve as relevant or predominant mechanisms of clinical resistance. One reason for this may include an essential role for the micro-environment in driving resistance to therapy, a component that is devoid in the experimental protocol/setup discussed thus far. Indeed, several studies have shown that anti-cancer agents that are capable of killing tumor cells are rendered ineffective when the tumor cells are cultured in the presence of stromal cells implying innate mechanisms of resistance conferred by the stroma^37,38. To identify such stroma-induced acquired resistance mechanisms, one may consider performing in vitro co-culture or in vivo tumor resistance assays. Since the former assay is quite complex, many have resorted to generating drug-resistant tumor xenografts to address the potential role of the stroma in driving resistance. Such studies have uncovered both identical⁵ and unique³⁹ mechanisms of resistance relative to in vitro selection, implying that the stroma may indeed play a role in the latter. However, one must be mindful of the length of time it may take to generate such resistant tumors and the complexity of the follow-up genomic analysis-complexities due to the intra-tumoral molecular and cellular heterogeneity.

Target identification

In addition to uncovering drug resistance mechanisms, this NGS-based genomic profiling approach can also be applied to identify cellular targets of chemical probes. Historically, multiple unbiased methods have been used to identify the cellular mechanisms of action and targets of low-molecular weight chemicals with biological activities, including affinity purification coupled with quantitative proteomics, yeast genomic methods, RNAi screening, and computational inference approaches⁴⁰. As an extension to elucidation of drug-resistance mechanisms using NGS-based genomic or transcriptomic profiling of phenotypically resistant cell populations, identification of unique recurrent single nucleotide variations (SNVs) or expression alterations that enable resistance can offer insights into functional cellular targets of compounds. This is based on the idea that a subset of resistance mechanisms observed may involve recurrent mutations in genes that encode the direct protein targets of the small molecule. Recently, several reports validated the utility of the approach, particularly by combining with other approaches including large-scale cancer cell line sensitivity profiling, to revealing the cellular targets of small-molecule probes^9,10.

Materials

48-well plates	Fisher Scientific	07-200-86	Expanding clones
96-well plates	Fisher Scientific	07-200-588	Generating GI50 curves
CellTiter-Glo	Promega	G7572	Viability testing
Cloning discs (3 mm)	Sigma	Z374431	Picking clones
Sterile forceps	Unomedical	DF8088S	Picking clones
RNeasy Plus RNA extraction kit	Qiagen	74134	Isolating RNA
Blood and Tissue DNeasy extraction kit	Qiagen	69581	Isolating gDNA
GATK	The Broad Institute		Indel realigner
MuTect	The Broad Institute		Paired variant calling tool
Oncotator	The Broad Institute		Variant annotation tool
MutationAccessor	The Broad Institute		Functional impact prediction tool