Generation af induceret pluripotente stamceller fra Frozen Buffy Coats hjælp Ikke integrere episomale plasmider
Summary
Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) repræsenterer en kilde til patient-specifikke væv til kliniske applikationer og grundforskning. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til at omprogrammere humane perifere mononukleære celler (PBMNCs) opnået fra frosne buffy coats i virale-fri iPSCs anvender ikke-integrerer episomale plasmider.
Abstract
Somatiske celler kan omprogrammeres til induceret pluripotente stamceller (iPSCs) ved at tvinge ekspression af fire transkriptionsfaktorer (oktober-4, Sox-2, KLF-4, og c-myc), typisk udtrykt af humane embryonale stamceller (hESCs) . På grund af deres lighed med hESCs er iPSCs blevet et vigtigt redskab for potentielle patient-specifikke regenerativ medicin, undgå etiske spørgsmål i forbindelse med hESCs. For at opnå celler, der er egnede til klinisk anvendelse, skal genereres for at undgå transgen reaktivering, ændret genekspression og misvisende differentiering transgene-fri iPSCs. Desuden er det nødvendigt med en yderst effektiv og billig omprogrammering metode til at udlede tilstrækkelige iPSCs til terapeutiske formål. Givet dette behov, en effektiv ikke-integrerende episomalt plasmid tilgang er at foretrække valg for iPSC afledning. Øjeblikket den mest almindelige anvendte celletype til omprogrammering formål er fibroblaster, isolering af hvilket kræver vævsbiopsi, en invasive kirurgiske procedure for patienten. Derfor humant perifert blod repræsenterer den mest tilgængelige og mindst invasive væv til iPSC generation.
I denne undersøgelse er en omkostningseffektiv og viral-fri protokol ved at anvende ikke-integrerende episomale plasmider rapporteres til generering af iPSCs fra humane perifere mononukleære celler (PBMNCs) fra frosne fibrinlag efter fuldblod centrifugering og uden densitetsgradient separation.
Introduction
I 2006 gruppen af Shinya Yamanaka 1 demonstreret for første gang, at somatiske celler fra voksne mus og mennesker kan omdannes til en pluripotent tilstand ved ektopisk udtryk for fire omprogrammering faktorer (oktober-4, Sox-2, KLF-4, og c-Myc), genererer de såkaldte induceret pluripotente stamceller (iPSCs) 2. Patientspecifikke iPSCs ligner humane embryonale stamceller (hESCs) i form af morfologi, spredning og evnen til at differentiere til de tre-kim celletyper (mesoderm, endoderm og ektoderm), mens der mangler de etiske betænkeligheder forbundet med brugen af hESCs og omgåelse muligt immunafstødning 3. Således iPSCs fremstå som en af de vigtigste kilder til patient-specifikke celler til grundforskning, narkotika screening, sygdom modellering, evaluering af toksicitet, og regenerativ medicin formål 4.
Adskillige metoder er blevet anvendt til iPSC generation: virale integrere vektorer(Retrovirus 5, lentivirus 6), viral ikke-integrerende vektorer (adenovirus 7), Sendai-virus 8, BAC transposoner 9, episomale vektorer 10, proteiner 11 eller RNA levering 12. Selv om brugen af virus-medieret metoder kan føre til højeffektiv omprogrammering, virale vektorer integreres i genomet i værtsceller og derfor potentielt tilfældig insertionsmutagenese, kan permanent ændring af genekspression, og reaktivering af tavshed transgener under differentiering ikke udelukkes 13.
At gøre iPSCs sikrere for regenerativ medicin, er blevet gjort en indsats for at udlede iPSCs uden integration af exogent DNA i cellulære genomer. Selvom punktafgiftspligtige virale vektorer og transposoner er blevet udviklet, er det stadig uklart, om korte vektorsekvenser, som uundgåeligt forbliver i de transducerede celler efter excision, og transposasen udtryk, kunne fremkalde ændringer i celleular funktion 13. På trods af sin høje omprogrammering effektivitet, Sendai-virus udgør en dyr strategi og nå-through licensaftaler bekymringer med det firma, der udviklede dette system har potentiale til at begrænse dens anvendelse i translationelle studier. Desuden behovet for direkte indføring af proteiner og RNA kræver multiple levering af omprogrammering molekyler med de iboende tekniske begrænsninger Dette indfører, og samlet omprogrammering effektivitet er meget lav 14. Notatet har omkostningseffektive virale-frie og ikke-integrere metoder baseret på anvendelse af episomale plasmider blevet rapporteret for omprogrammering af hudfibroblaster 15. Specifikt i dette arbejde, besluttede vi at bruge kommercielle tilgængelige integration-fri episomale plasmider, som tidligere rapporteret 10,15.
Til dato repræsenterer hudfibroblaster den mest populære donor celletype 5. Imidlertid har andre cellekilder været succeshave formået omprogrammeres i iPSCs herunder keratinocytter 16, knoglemarv mesenchymstamceller 17, adipøst stromaceller 18, hårsækkene 19, og dental pulp celler 20. Isoleringen af disse celler kræver kirurgiske procedurer, og der er behov for flere uger til in vitro celle ekspansion for at etablere en primær cellekultur.
På denne baggrund, udvælgelse af start celletype er kritisk, og det er lige så vigtigt at kunne producere iPSCs fra let tilgængelige og mindre invasive væv såsom blod. Begge navlestrengsblod mononukleære celler (CBMNCs) 21,22 og perifere mononukleære celler (PBMNCs) 14,22-24 repræsenterer egnede kilder til celler til afledning af iPSCs.
Selvom effektiviteten af voksne PBMNC omprogrammering er 20-50 gange lavere end for CBMNCs 22, forbliver den mest bekvemme celletype til formålet prøveudtagning. IFaktisk PBMNC sampling har den fordel af at være minimalt invasiv, og desuden, at disse celler ikke kræver større ekspansion in vitro før omprogrammering eksperimenter. Til dato har forskellige protokoller rapporteret, at PBMNCs efter densitetsgradient separation kan fryses og optøs dage til flere måneder efter frysning og udvidet for få dage før omprogrammering ind iPSCs 22,23. Ikke desto mindre, så vidt vi er opmærksomme ingen rapporter har beskrevet omprogrammering af PBMNCs fra frosne buffy coats. Vigtigere, frosne buffy coats indsamlet uden densitetsgradient separation repræsenterer de mest almindelige blodprøver opbevaret i stor skala biobanker fra befolkningsundersøgelser, hvilket repræsenterer en lettilgængelig pulje af materiale til iPSC produktion, der undgår yderligere indsamling prøve.
Heri rapporterer vi for første gang genereringen af virale-fri iPSCs fra humane frosne fibrinlag, baseret på en tidligere beskrevet protokol 22. IDesuden blev iPSCs genereret fra frosne PBMNCs opnået efter densitetsgradient separation, som en kontrol protokol for de ikke-densitetsgradient oprensede PBMNC resultater.
Protocol
Representative Results
Discussion
I fortiden, den eneste måde at opnå menneskelige pluripotente stamceller bærer en bestemt genetisk mutation var at rekruttere forældre gennemgår præ-implantation genetisk diagnose og generere embryonale stamceller fra deres kasserede blastocyster 31,32. Ved hjælp af en omprogrammering tilgang, kan forskerne nu generere iPSCs fra patienter, der bærer stort set alle genotype. Muligheden for at starte fra et patient-specifik cellelinie og en let tilgængelig kilde er meget vigtigt, da det tillader en und…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The study was supported by the Ministry of Health and Department of Educational Assistance, University and Research of the Autonomous Province of Bolzano and the South Tyrolean Sparkasse Foundation.
Materials
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µL Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells–from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
