Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Summary

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Abstract

Somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) worden geprogrammeerd door het forceren van de expressie van vier transcriptiefactoren (oktober-4, Sox-2, Klf-4, en c-Myc), typisch uitgedrukt door menselijke embryonale stamcellen (hESCs) . Door hun gelijkenis met hESCs, hebben iPSCs een belangrijk instrument voor potentiële patiënt-specifieke regeneratieve geneeskunde te worden, het vermijden van ethische kwesties in verband met hESCs. Om die geschikt zijn voor klinische toepassing, verplichting-transgen vrij iPSCs worden gegenereerd om transgene reactivering, veranderde genexpressie en differentiatie misplaatste voorkomen. Bovendien is een zeer efficiënte en goedkope herprogrammering nodig is, moet voldoende iPSCs leiden voor therapeutische doeleinden. Gezien deze behoefte, een efficiënte niet-integrerende episomaal plasmide aanpak is de voorkeur keuze voor iPSC afleiding. Momenteel is de meest voorkomende celtype voor herprogrammering doeleinden fibroblasten, de isolatie die alleen door een weefselbiopsie, een invasive chirurgische ingreep voor de patiënt. Daarom humaan perifeer bloed is de meest toegankelijke en minst invasieve weefsel voor iPSC genereren.

In deze studie wordt een kosteneffectieve en virale free-protocol met behulp van niet-integrerende episomale plasmiden gerapporteerd voor het genereren van iPSCs uit menselijk perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats na volbloed centrifugering en zonder dichtheidsgradiënt gescheiden.

Introduction

In 2006 heeft de groep van Shinya Yamanaka ¹ aangetoond voor de eerste keer dat de somatische cellen van volwassen muizen en mensen kan worden omgezet in een pluripotente toestand door ectopische expressie van vier herprogrammering factoren (oktober-4, Sox-2, Klf-4, en c-Myc), genereert de zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) ^2. Patiëntspecifieke iPSCs lijken humane embryonale stamcellen (hESCs) qua morfologie, proliferatie en het vermogen om te differentiëren in de drie-kiem celtypen (mesoderm, endoderm en ectoderm), terwijl zonder de ethische bezwaren verbonden aan het gebruik van hESCs en bypassing mogelijke afstoting ^3. Aldus iPSCs weergegeven als een van de belangrijkste bronnen van patiënt-specifieke cellen voor basisonderzoek, drug screening, ziektemodel, evalueren van de toxiciteit en regeneratieve geneeskunde doeleinden ^4.

Verschillende benaderingen zijn gebruikt iPSC generatie virale integrerende vectoren⁽⁵ retrovirus, lentivirus ^6), niet-integrerende virale vectoren (adenovirus ^7), Sendai-virus ^8, BAC transposons ^9, episomale vectoren ^{10, 11} eiwitten of RNA delivery ^12. Hoewel het gebruik van virus-gemedieerde werkwijzen kunnen leiden tot hoge efficiency herprogrammering, virale vectoren integreren in het genoom van gastheercellen en daardoor potentiële willekeurige mutagenese kan permanente verandering van genexpressie en reactivering van zwijgen transgenen tijdens differentiatie niet uitgesloten ^13.

Om iPSCs veiliger regeneratieve geneeskunde maken, zijn pogingen gedaan om iPSCs afleiden zonder integratie van exogeen DNA in cellulair genoom. Hoewel accijnsgoederenverkeer virale vectoren en transposons zijn ontwikkeld, is nog onduidelijk of korte vectorsequenties, wat onvermijdelijk blijven de getransduceerde cellen na excisie en transposase expressie verandering in cel kan inducerenular functioneren ^13. Ondanks zijn hoge herprogrammering efficiëntie, Sendai virus vertegenwoordigt een dure aanpak en bereiken-door licenties zorgen met het bedrijf dat dit systeem ontwikkeld, het potentieel hebben om de toepassing ervan in translationeel onderzoek te beperken. Bovendien is de noodzaak om het monster direct van eiwitten en RNA vereist meerdere afgifte herprogrammeren moleculen met de inherente technische beperkingen dit brengt en herprogrammering algehele efficiëntie zeer laag ^14. Opmerkelijk zijn rendabel viraal-vrije en niet-integrerende methoden gebaseerd op het gebruik van episomale plasmiden met succes gerapporteerd voor de herschikking van huidfibroblasten ^15. Specifiek, in dit werk hebben we besloten om commercieel beschikbare integratie vrije episomale plasmiden gebruiken, zoals eerder gemeld ^10,15.

Tot op heden huidfibroblasten vormen de meest populaire donor celtype ^5. Echter, andere mobiele bronnen succes geweestalle codes opnieuw geprogrammeerd in iPSCs waaronder keratinocyten ^16, beenmerg mesenchymale stamcellen ^17, stromacellen in vetweefsel ^18, haarzakjes ^19, en tandheelkundige pulp cellen ^20. De isolatie van deze cellen vereist chirurgische procedures, en enkele weken nodig om in vitro celexpansie om een primaire celkweek stellen.

In dit licht is de keuze van het starten celtype is kritisch en is het even belangrijk om te kunnen iPSCs produceren van gemakkelijk toegankelijke en minder invasief weefsels zoals bloed. Zowel navelstrengbloed mononucleaire cellen (CBMNCs) ^21,22 en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) ^14,22-24 vertegenwoordigen geschikte bron van cellen voor de afleiding van iPSCs.

Hoewel de efficiëntie van volwassen PBMNC herprogrammering 20-50 keer lager dan die van CBMNCs ^22, blijven ze de meest geschikte celtype voor bemonstering doel. InEigenlijk PBMNC bemonstering heeft het voordeel dat minimaal invasief, en bovendien zijn deze cellen niet uitgebreid in vitro expansie voor herprogrammering experimenten vereist. Tot nu toe zijn verschillende protocollen gemeld dat PBMNCs na dichtheidsgradiënt scheiding kan worden ingevroren en ontdooid dagen tot enkele maanden na invriezen en uitgebreid voor enkele dagen vóór herprogrammeren in iPSCs ^22,23. Echter zover wij weten geen rapporten herprogrammering van PBMNCs uit bevroren buffy coats beschreven. Belangrijk is bevroren buffycoats verzameld zonder dichtheidsgradiënt scheiding vertegenwoordigen de meest voorkomende bloedstalen opgeslagen in grootschalige biobanken van de bevolking studies, dus neerkomt op een gemakkelijk toegankelijke pool van materiaal voor iPSC productie die verder monstername voorkomt.

Hierin beschrijven we voor het eerst de productie van virale-vrij iPSCs uit humane bevroren buffy coats, gebaseerd op een eerder beschreven protocol ^22. InDaarnaast werden iPSCs geproduceerd uit bevroren PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding als een controleprotocol voor non-density gradient gezuiverde PBMNC resultaten.

Protocol

Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMNCs) werden geïsoleerd uit humaan perifeer bloedmonsters van gezonde donoren na ondertekend informed consent en goedkeuring van de Ethische Commissie van de provincie Zuid-Tirol. Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de principes die in de Verklaring van Helsinki. Alle gegevens werden verzameld en anoniem geanalyseerd. 1. Isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) PBMNCs verkregen uit buffy coats na volbloed ce…

Representative Results

In dit onderzoek werd een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van virale free iPSCs door herprogrammering van PBMNCs geïsoleerd uit bevroren buffy coats na volbloed centrifugeren en vergelijking met herprogrammering van PBMNCs verkregen na dichtheidsgradiënt scheiding wordt gerapporteerd. Figuur 1A toont een schematische weergave van de gedetailleerde protocol. Na ontdooien de geïsoleerde PBMNCs, dat een typische ronde vorm, geëxpandeerd specifieke bloed kweekmedium 14 dagen <strong…

Discussion

In het verleden was de enige weg om humane pluripotente stamcellen die een bepaalde genetische mutatie te verkrijgen, omdat de ouders die een pre-implantatie genetische diagnose werven en het genereren embryonale stamcellen uit hun afgedankte blastocysten ^31,32. Met behulp van een herprogrammering aanpak kunnen onderzoekers nu genereren iPSCs van patiënten dragen vrijwel elk genotype. De mogelijkheid te gaan van een patiënt-specifieke cellijn een gemakkelijk toegankelijke bron van groot belang omdat daarmee…

Materials

Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µL Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit