我々は、マウスにおけるモータユニット機能の生体モニタリングに許可する洗練されたプロトコルを提示します。技術は、坐骨神経によって神経支配マウスの後肢筋の複合筋活動電位(CMAP)とモータユニット番号推定(MUNE)を測定することが記載されています。
Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the functional status of a motor unit pool in vivo. These measures can provide insight into the normal development and degeneration of the neuromuscular system. These measures have clear translational potential because they are routinely applied in diagnostic and clinical human studies. We present electrophysiological techniques similar to those employed in humans to allow recordings of mouse sciatic nerve function. The CMAP response represents the electrophysiological output from a muscle or group of muscles following supramaximal stimulation of a peripheral nerve. MUNE is an electrophysiological technique that is based on modifications of the CMAP response. MUNE is a calculated value that represents the estimated number of motor neurons or axons (motor control input) supplying the muscle or group of muscles being tested. We present methods for recording CMAP responses from the proximal leg muscles using surface recording electrodes following the stimulation of the sciatic nerve in mice. An incremental MUNE technique is described using submaximal stimuli to determine the average single motor unit potential (SMUP) size. MUNE is calculated by dividing the CMAP amplitude (peak-to-peak) by the SMUP amplitude (peak-to-peak). These electrophysiological techniques allow repeated measures in both neonatal and adult mice in such a manner that facilitates rapid analysis and data collection while reducing the number of animals required for experimental testing. Furthermore, these measures are similar to those recorded in human studies allowing more direct comparisons.
運動単位数推定法(MUNE)はもともとマコーマスらによって記載されました。 30年以上にわたり前に1。オリジナルの技術は最大下の増分を取得するために、刺激の漸増を用いる複合筋活動電位(CMAP)記録技術の改変でした。これらの増分は加算され、単一のモータ部電位(SMUP)の推定サイズを決定するために平均化しました。このサイズは、モータユニットの数は、試験される筋肉を神経支配推定するCMAP応答に分けました。元の説明に続いて、電気生理学的応答および増分力(機械的)測定の両方を使用して多数のバリエーションがヒトの研究および動物モデル2の両方で使用されてきました。 MUNE技術は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、3,4のマウスモデルを研究するためにShefnerらによって修正されました。
現在の説明では、我々詳細simplif実行するために迅速でMUNE技術のIED修正。重要なことは、CMAPとMUNEは、新生児および成体マウス5-8の両方で信頼性の高い対策を可能にします。経験豊富な動物あたり10〜20分でこれらの施策を実行することができ、かつ反復測定は、長手方向のデータ 5の取得を可能にする実現可能です。現在の研究では、我々は、臨床electrodiagnosticシステムを採用しています。我々の経験では、臨床electrodiagnosticシステムは、生体内での電気生理学的データの迅速かつ効率的な捕獲のために最適化され、それにもかかわらず、標準的な電気生理学リグを簡単に、このアプリケーションに適合させることができます。
MUNEとCMAPは頻繁に調査研究で、そのようなALSおよび脊髄性筋萎縮症(SMA)9、10のような神経筋疾患の患者を監視するのに利用し、臨床的に関連する尺度である。例えば、SMAで、CMAPとMUNEは、年齢、重症度および臨床とよく相関します機能10-14の措置。どちらの対策は、低侵襲性であり、同じ個体において縦方向に機能の評価を可能にします。重要なことは、これらの措置は、皮質運動ニューロンによる活性化やモータユニットの動員を測定することはできませんが、彼らは運動ニューロンの完全性とその機能的対応、モータユニットの臨床的に関連する評価を提供します。
神経筋疾患の動物モデルは、ヒト疾患の発症機構の理解に、潜在的に有効な治療薬の前臨床開発に重要です。アウトカム指標とすることができるバイオマーカーを変換する機能容易にし、ヒトの臨床試験への有望な前臨床所見の翻訳を早めることができ、種を超えて利用しました。いくつかのグループは、以前にマウスモデル2-4、15-22モータユニット関数を推定するために電気力(機械的)測定の両方を利用しています。ための措置の相対的な複雑さのために、我々は、マウスにおけるより広範な使用と実装を可能にするために視覚的な形式で、これらの技術に磨きをかけてきました。ビデオデモおよび命令のフォーマットは、手順の重要なステップを強調表示すると潜在的な落とし穴に対処することができます。運動ニューロン疾患の潜在的な治療法の前臨床試験に、これらの技術の適用は、ヒト疾患のマウスからの推定上の治療の翻訳を改善することができます。
CMAPとMUNE応答を取得する過程でいくつかの重要なステップがあります。適切かつ一貫性のある記録電極の配置や後肢との十分な電極接触肢は、振幅の再現可能な測定のために重要であり、バックグラウンドノイズを減少させます。したがって、後肢の皮膚と電極との間の密接な接触は、一貫して確認する必要があります。我々は、表面電極は針電極より一貫性のCMAPとMUNEレコーディングを提供することを見出しました。これにより、非常に薄い皮下組織に、針の記録面の小さな動きは、CMAPの振幅の大きな変動につながる可能性があります。また、針電極のより侵襲的な性質は、新生仔マウスまたは潜在的な筋肉の破壊および損傷に起因する長期的な研究には最適ではありません。特定の筋肉が他と比べてより多くのまたはより少ない関与し、これは、ALSマウスモデル21で報告されている場合に、非選択的、表面電極記録の一つの潜在的な欠点は、減少表現型分解能の可能性に関する。
平均SMUPサイズを取得することはCMAPに比べて技術的に困難です。小さいRESPONSのためにバックグラウンドノイズ(μVなくmVの範囲内の)Eの大きさは、より問題となり得ます。バックグラウンドノイズは、接地電極、陰極、陽極を調整し、実験の近傍に他の電気機器をチェックすることによって低減することができます。典型的には、細胞内の電気生理学的用途に使用されるファラデーケージは、必要とされません。個々SMUP応答の視覚決意を取得するための最も困難なスキルであり、十分な再現性と一貫性のある結果のための練習が必要です。これは、記録されているSMUPsが最大CMAP応答の時間内に開始することを確認することが重要です。我々は実行すると、細胞内および評価者間信頼性を向上させるために、このプロセスはより簡単にするために、個々の増分応答の受け入れのための基準を定義しています。
インクリメンタルMUNE技術の一つの潜在的な欠点が原因モトの交互に機能的な運動単位の数を過大評価する可能性を含みますR単位。我々はShefner らと同様の手法を用いてきました。その中で各応答が再現可能に、この現象3の影響を軽減するために3回の合計を見られるべきです。
我々の経験では、臨床electrodiagnosticシステムが原因でコントロールのしやすさを可能にする改良された審査官-electrodiagnosticシステムインタフェース人間工学に、本明細書に記載された研究用に最適化されています。私たちの研究室で利用さ2チャンネルシステムは、デジタル変換器24ビットのアナログとアンプとチャンネルあたり48 kHzでのサンプリングレートを使用して、2つの非スイッチアンプチャンネルが装備されています。ハードウェアゲインは10nVから100 MV /分割に調整することができます。低域フィルタは、0.2ヘルツ、5 kHzの範囲であり、高周波フィルタの設定は、30ヘルツ、10 kHzの範囲です。定電流刺激装置は(:、:0.02〜1ミリ秒の持続時間0-100 mAの強度)が使用されます。ほとんどの臨床システムは、同様の適切な特徴を有しており、十分にCMAPとMUNE応答を記録するために調整することができます。 Additionally、標準電気生理学リグを十分にCMAPとMUNEを記録するために組み立てることができますが、インタフェースは、刺激調整とCMAPとSMUP応答の迅速な同定を容易にするために調整する必要があります。
我々は以前CMAPの技術を利用しているとMUNEは成人5に出生後早期の期間中に、マウスにおける後肢の坐骨神経支配筋の迅速かつ再現性の評価を可能にするために、ここで説明します。運動機能のための行動試験は現実的ではありませんか信頼性が低いときに、これらの技術は、マウスモデルにおいて評価を可能にします。新生マウスに、この技術の適用は、モータユニットの開発の研究を促進し、運動ニューロンの神経支配と剪定の我々の理解を拡大する可能性を秘めています。例えば、我々はMUNEで記録機能モーターユニットの数は、最初の2週間の間にpolyneuronalからmononeuronal神経支配に剪定時に増加することが示されています新生児マウス5での生活の秒。この技術を用いて長時間にわたってマウスをテストする能力は、末梢神経損傷、遺伝性神経筋障害および老化にモータユニットの応答の研究に役立ちます。
The authors have nothing to disclose.
WDA is supported by grant funding from NIH-NICHD (5K12HD001097-17) and Cure SMA. SJK is supported by grant funding from NINDS (K08NS067282 and U01NS079163).
Pro trimmer Pet Grooming Kit | Oster | 078577-010-003 | clippers for hair removal |
Synergy T2 EMG system | Natus Neurology | Model no longer available | portable electrodiagnostic system |
monopolar needles 28 gauge | Teca | 017K121 | cathode and anode stimulating electrodes |
Alpine Biomed Digital Ring Electrode with twisted wires and 1.5 mm TP connectors. | Alpine Biomed | 9013S0312 | recording electrodes |
Helping Hands alligator clip with iron base | Radio Shack | 64-079 | Maintaining recording electrode placement |
Spectra 360 Electrode Gel | Parker Laboratories | 9013G5012 | applied to reduce skin impedance |
monoject curved tip irrigating syringe | Covidien | 81412012 | utilized for application of electrode gel |
EMG needle cable | Teca | 902-RLC-TP | to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator |
Disposable 2" x 2" Electrode or similar trimmed as needed | Carefusion | 019-415000 | ground electrode |
Small Heating Plate with built-in RTD sensor, 15x10cm | World Precision Instruments | 61830 | warming plate used with animal temperature controller to transmit heat to animal |
Silicone pad for use with ATC2000 | World Precision Instruments | 503573 | conductive removable pad to cover warming plate for easy cleaning |
Animal temperature controller | World Precision Instruments | ATC2000 | low noise animal heating system for maintaining animal temperature |
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment | Puralube | 26870 | applied during anesthesia to avoid corneal injury |