Индукция и оценка ишемии-реперфузии в Лангендорфа-перфузии сердца крыс
Summary
The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.
Abstract
The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.
Introduction
Выяснение событий, лежащих в основе сердечной ответ на оба ишемии и реперфузии имеют важное значение в улучшении лечения инфаркта миокарда и сердечной 1 хирургических процедур, которые требуют пережатия аорты 2. В то время как модели в естественных условиях ишемии реперфузионного повреждения позволяют очень полезный анализ конечной точки, они не столь эффективны для изучения функциональных последствий ишемии реперфузионного повреждения остро в режиме реального времени. Кроме того, в естественных условиях модели ишемии реперфузии обычно производят значительное изменчивость размера инфаркта, и прямые поставки препарата к сердцу во время реперфузии является сложной задачей. Использование сердечного системы Лангендорфа изолированы для изучения ишемии реперфузии позволяет в реальном времени функциональной оценки фармакологической терапии, равномерной площади инфаркта ткани и мгновенной доставки лекарственного средства непосредственно к миокарду.
Впервые описан бу Оскара Лангендорфа в 1895 3, Лангендорфа изолированные сердце надежный моделью для изучения ишемии реперфузии, что оно использовалось в ишемии реперфузии исследований за последние 40 лет 4,5. Вот некоторые изменения сделаны для оптимизации изолированного сердца для функционального анализа. В месте пункции аорты, а сердце бьется гарантирует, что сердце не испытывать ишемический предварительной подготовки, которая бы изменить результаты ишемии реперфузии испытаний 6. Чтобы облегчить это, трахеотомия выполняется, позволяя вентиляции и обеспечения физиологической стабильности крысы во время операции. Сердце затем прикрепляется к водяной рубашкой спиральной стеклянную колонку, через которую Кребса Хенселейта буфер доставляется по ретроградной перфузии непосредственно в аорту. Солевой раствор на баллон, заполненный вставлен в левый желудочек и прикреплен к датчику давления, который позволяет в режиме реального времени измерения давления внутри желудочка ANд расчет нескольких функциональных параметров. По завершении эксперимента, сердца промывают холодной солевой раствор, чтобы задержать сжатие и мгновенно замораживали в жидком азоте, чтобы позволить потоку анализ ДНК, РНК и белка уровней. Таким образом изменен, Лангендорфа перфузии сердца служит эффективной системы прямого мониторинга физиологического эффекта фармакологических вмешательств в любое время остро во время ишемии реперфузии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изолированных перфузии сердца крысы могут быть успешно использованы для изучения влияния фармакологического вмешательства на сердечную предварительной ишемии реперфузии 9. Тем не менее, существуют некоторые существенные шаги по процедуре, которые должны быть стандартизирова?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта публикация была поддержана Южная Каролина Клиническая и трансляционных исследований (SCTR) института с академической дома в Медицинском университете Южной Каролины, NIH / NCATS Грант Количество UL1 TR000062. Дальнейшая поддержка была предоставлена В.А. заслуга премии BX002327-01 к DRM. DJH поддержали NIH / NCATS Грант Количество TL1 TR000061 и NIH Grant Номер T32 GM008716. СЭО поддержали NIH Grant Номер T32 HL07260.
Materials
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | 203726 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | RES20765-A7 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich | C8106 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Octanoic Acid | Sigma Aldrich | C2875 | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Medical Pressure Transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| Masterflex Peristaltic Pump | Cole Parmer | EW-07521-40 | |
| Masterflex Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-07518-10 | |
| Heated circulating water bath | Lauda | M3 | |
| Tubing Flow Module | Transonic | TS410 | |
| Modular Research Console | Transonic | T402 | |
| Inline flow sensor | Transonic | ME2PXN | |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | PL3508 | |
| LabChart data acquisition software | AD Instruments | MLU60/8 |
References
- Bainey, K. R., Armstrong, P. W. Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction. American Heart Journal. 167 (5), 637-645 (2014).
- Beyersdorf, F. The use of controlled reperfusion strategies in cardiac surgery to minimize ischaemia/reperfusion damage. Cardiovascular Research. 83 (2), 262-268 (2009).
- Langendorff, O. Untersuchugen am überlebenden Säugethierherzen. Pflügers Archives. 61, 291-307 (1895).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Tyers, G. F., Todd, G. J., Neely, J. R., Waldhausen, J. A. The mechanism of myocardial protection from ischemic arrest by intracoronary tetrodotoxin administration. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 69 (2), 190-195 (1975).
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. The Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. American Heart Journal. 101 (5), 593-600 (1981).
- Aune, S. E., Herr, D. J., Mani, S. K., Menick, D. R. Selective inhibition of class I but not class IIb histone deacetylases exerts cardiac protection from ischemia reperfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 138-145 (2014).
- Yellon, D. M., et al. The protective role of heat stress in the ischaemic and reperfused rabbit myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 24 (8), 895-907 (1992).
- Khaliulin, I., et al. Temperature preconditioning of isolated rat hearts–a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore. The Journal of Physiology. 581 (Pt 3), 1147-1161 (2007).
- Molojavyi, A., et al. Effects of ketamine and its isomers on ischemic preconditioning in the isolated rat heart). Anesthesiology. 94 (4), 623-629 (2001).
- Asfour, H., et al. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. The Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Sill, B., Hammer, P. E., Cowan, D. B. Optical mapping of langendorff-perfused rat hearts. The Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in langendorff rat model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 23 (4), 327-331 (2009).
- Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. Mouse isolated perfused heart: Characteristics and cautions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (11), 867-878 (2003).
- Reichelt, M. E., Willems, L., Hack BA, ., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the langendorff-perfused mouse heart model. Experimental Physiology. 94 (1), 54-70 (2009).
- Xie, M., et al. Histone deacetylase inhibition blunts ischemia/reperfusion injury by inducing cardiomyocyte autophagy. Circulation. 129 (10), 1139-1151 (2014).
