In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
For mange år, har forskning på nevrodegenerative tilstander som iskemisk hjerneslag eller traumatisk hjerneskade fokusert på utvikling av nervecellene behandlinger som tar sikte på å fremme neuronoverlevelse i akutt hjerneslag fasen. Det store flertallet av medisinsk behandling som har vist seg å være effektive i gnagermodeller mislykkede når oversatt til klinikken. Grunner til dette terapisvikt, men er ikke begrenset av mangel på vedvarende virkninger av rusmidler fører til vedvarende funksjonell nevrologisk utvinning. Det er derfor viktig å utvikle strategier som fremmer hjerne ombygging på lengre sikt. Fordi fremme neuronal overlevelse alene er ikke tilstrekkelig til å tillate vellykket slag utvinning, som foreslått av det store antall mislykkede forsøk nevrobeskyttelse, stimulering av neuronal plastisitet har nylig fått stor interesse på feltet.
Midler for levering av legemidler er intraperitoneal injeksjon, hale intra jegnjection, femoral injeksjon, enkel stereotaktisk injeksjon av vektorer inn i hjernen og fortsatte konstant levering av miniosmotic pumper. Det sistnevnte kan omfatte systemisk levering, hvis pumpen ikke har en kanyle, eller som kan organ rettet, som vi har vist for levering inn i hjernen. Med unntak av miniosmotic pumper og anvendelsen av virale vektorer, vil alle andre strategier indusere varierende medikamentkonsentrasjoner. For langsiktige eksperimenter blir det derfor nødvendig å sende inn dyret til å stresse med å motta hyppige injeksjoner. BBB pålegger en viktig hindring for hjernen opptak av proteiner eller medikamenter fra blodet, noe som resulterer i et behov for store protein eller medikamentdoser for å oppnå terapeutiske konsentrasjoner i hjernen. For eksempel Pellegrini et al. (2013) 5 levert rhEpo ved intraperitoneal injeksjon i en dose ekvivalent med 75 IE / dag for et dyr av 30 g (750 IU / dag for en 300 g rotte). Til sammenligning målrettet levering av rhEpo til hjernen tillatt oss å bruke en mye lavere dose på bare 10 IE / dag i vår studie for vellykket hjerneslag utvinning, som gjorde oss i stand til å oppnå bedring over et stort tidsskala til en fast rente på 0,25 mL / t.
I dette arbeidet har vi vist en fremgangsmåte for implantering av minipumper med en kanyle koblet til skallen for å levere den plastisitet fremmende protein rhEpo direkte inn i ventrikkelen, og derved omgå BBB. Ved denne metode rhEpo fremmet nevrologisk utvinning i en rekke måter, inkludert reduksjon av infarktstørrelse, reduksjon av glial arrdannelse og induksjon av angiogenese. rhEpo også fremmet neuronoverlevelse og økt anslag fra contralesional motor cortex mot denerveres rød kjerne og ansikts kjerner. Den spirende av fibrene ble avslørt ved injeksjon av anterokanalen tracer BDA inn i motoren cortex (figurene 4A og 5A). En funksjonell korrelat til den spirende av fibrene er provided ved forbedring av motoriske ferdigheter (Figur 5B). I tillegg har vi vist at den samme metode for sporstoffinjeksjonskanalen kan brukes til å avsløre thalamo-cortical forbindelser ved injeksjon av det retrograde kanalen tracer FG (figur 6B).
Ved fremstillingen av den miniosmotic pumpen, er det viktig å vurdere målpunktet og bruken av avstandsstykker. Vi bruker en spacer for å redusere lengden av nålen ved 0,5 mm som på denne måten selve spissen av nålen er i kontakt med ventrikkel ved gitte koordinater (-0,2 mm caudal, 0,9 mm lateral, 2,5 mm dorso ventral Med i forhold til bregma). Men hvis dypere strukturer er målet for forskningen, så vil ingen avstandsstykker vil være nødvendig. Likeledes, hvis en mer ekstern leveringspunkt er ønskelig (f.eks., Cortex), og flere avstandsskiver vil være nødvendig. Kateteret må være lang nok slik at pumpen ikke er for tett inntil hodet, da det vil hindre bevegelsene til mouse, men også ikke så lenge som en gang er implantert overdreven lengde kan føre kateteret til å bøye, og dermed øke risikoen for kanylen fjerning av den naturlige bevegelse av musen. En del av 2 cm av kateteret gir meget gode resultater når det gjelder mobilitet og stabilitet av implantatet (figur 1 og 2). Inkubasjon av pumpen ved 37 ° CO / N gjør at pumpen umiddelbart begynne å pumpe medikamentet inn i hjernen ved tidspunktet for implantasjon.
I miniosmotic pumpen implantering er det viktig å sikre at hodeskallen er skikkelig tørket før implantering av kanylen. Vanligvis rengjøring med 70% etanol vil bevege benet til tørk, men hvis kontinuerlig blødning er funnet, vil berøre skallen forsiktig med en cauterizer helt tørke den. Det er viktig å sikre at innføringen av nålen som er vertikal og sakte som mulig. I posisjon, og mens limet tørker, plassere fingeren på toppen av kanylen hindrer den fra å bevege seg sideveis oveh skallen. Spesiell forsiktighet bør gis til såret og plassering av kanylen. Det er viktig at snittet ikke blir utført nøyaktig over midtlinjen av skallen, men litt til høyre side. Ved lukking av såret, hvis innsnitt ble gjort på midtlinjen, vil huden bli overstrekkes, og dermed øke faren for sår åpning. Gjøre innsnitt litt til den ene siden vil tillate sutur poeng for å være borte fra den høyeste delen av kanylen. Som en konsekvens vil det være mindre spenning på sutur punktene og såret vil gro på riktig måte. Dyr bør være i bur alene og sjekket hver dag, spesielt i løpet av de første 10-15 dager etter implantasjon. Ved sårdehiscens, sår må stenges så snart som mulig. Dersom kanylen er fjernet eller dyret presenterer en infeksjon, eksperimentet må være avsluttet. Re-implantasjon av kanylen er ikke anbefalt. Det er svært viktig for vellykket implantasjon å bruke tilstrekkelige mengder vev annonsehesive (ikke for mye!) da den forringer ben og øker risikoen for kanylen fjernes. Men bruker for lite lim vil heller ikke holde kanylen er festet til benet. De miniosmotic pumpene kan bære stoffer oppløst i et bredt spekter av substanser, som er den eneste begrensning for denne at oppløsningsmidlet er biokompatible. I tillegg, gitt at volumet er lite (200 ul) en må fastslå om konsentrasjonen som er nødvendig for forsøket er egnet og vil ikke forårsake utfelling inne i pumpen.
Tract tracing med enten anterograd eller retrograd tracere er et meget godt etablert teknikk for å studere hjernen tilkobling og plastisitet. Det må tas hensyn til bruk stereotaktiske rammer når injisering for å sikre nøyaktighet på målretting hjernen området man ønsker å studere (dvs. å unngå injeksjon på corpus callosum når injisere cortex).
For alle kirurgiske inngrep og for å redusere smerte oginflammasjon, bør dyrene behandles med 0,1 mg / kg Buprenorfin før intervensjonen og Caprofen ved 4 mg / kg en gang om dagen i tre dager etter inngrepet.
Som konklusjon, gir denne metoden et passende verktøy for å studere effekten av proteiner eller farmakologiske forbindelser i den skadde hjernen, som representerer en metode som er godt egnet for studier av hjernens plastisitet.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |