In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
Uzun yıllar boyunca, iskemik inme veya travmatik beyin hasarı gibi nörodejeneratif koşulları araştırma akut inme aşamasında nöronal canlılığı teşvik etmeyi amaçlamaktadır nöroprotektif tedavilerin geliştirilmesi üzerine odaklanmıştır. Kliniğe çevrilirken bulunmuştur ilaç tedavilerinin büyük çoğunluğu başarısız kemirgen modellerinde etkili olduğu bulunmuştur. Bu tedavi başarısızlığının nedenleri arasında, ancak fonksiyonel nörolojik iyileşme kalıcı sonuçlanan sürekli ilaç etkileri olmaması sınırlı değildir. Bu uzun vadede beyin yenileme teşvik stratejileri geliştirmek ve böylece önemlidir. Nöronal hayatta kalma promosyon yalnız başarılı inme kurtarma izin vermek için yeterli değildir, çünkü başarısız nöro çalışmaların çok sayıda tarafından önerilen, nöronal plastisite uyarılması son zamanlarda alanında büyük bir ilgi aldı.
Ilaç dağıtım olan intraperitoneal enjeksiyon, kuyruk intravasküler i için araçlarnjection femoral enjeksiyon, tek stereotaktik beyin içine vektörlerin enjeksiyon ve mini-ozmotik pompalar ile sabit teslim sürdürdü. Pompa bir kanül yoktur, ya da biz beyne teslimat için gösterdiği gibi, organı yönlendirilmiş edilebildiği takdirde ikincisi, sistemik teslimat içerebilir. Mini-ozmotik pompalar hariç ve viral vektörlerin kullanımı, tüm diğer stratejiler dalgalı ilaç konsantrasyonları neden olacaktır. Uzun süreli deneyler için böylece sıklıkla enjeksiyonlarını alan strese hayvan göndermek için gerekli olur. BBB beyinde terapötik konsantrasyonları elde etmek için büyük bir protein ya da ilaç dozlarına ihtiyaç sonuçlanan kan protein veya ilaçların beyne alınmasındaki için önemli bir engel getirmektedir. Örnek Pellegrini ve diğerleri için. 30 g (300 g bir fare için 750 IU / gün), bir hayvan için 75 lU / gün eşdeğer bir dozda intraperitonal enjeksiyon yoluyla rhEPO teslim (2013) 5. Buna karşılık, rhEp teslim hedeflenenbeyne o bize 0,25 ul / saat sabit bir hızda büyük bir zaman ölçeği üzerinde iyileşme elde etmemizi sağladı başarılı inme kurtarma için çalışmamızda, sadece 10 IU / gün çok daha düşük dozda kullanmak için izin.
Bu çalışmada biz, böylece BBB engellemeyi, ventrikül içine doğrudan plastisite teşvik protein rhEPO sunmak için kafatasına bağlı bir kanül mini pompalardan implantasyon yöntemini göstermiştir. Bu yöntem ile, rhEPO enfarktüs boyutunun azaltılması, glial yara oluşumunun azaltılmasına ve anjiyogenez indüksiyonu da dahil olmak üzere, bir dizi yolla, nörolojik düzelme sağlamıştır. rhEPO da nöronal hayatta kalma terfi ve Denerve kırmızı çekirdek ve yüz çekirdekleri karşı contralesional motor korteks gelen projeksiyonlar yükselmiştir. Liflerin filizlenme motor korteks (Şekil 4A ve 5A) içine anterograd yolu izleyici BDA enjeksiyonuyla ortaya çıktı. Liflerin filizlenmesi için fonksiyonel bir korelasyon prmotor becerilerinin geliştirilmesi (Şekil 5B) tarafından ovided. Buna ek olarak, sistem izleyici enjeksiyon için aynı yaklaşım retrograd yolu tracer FG (Şekil 6B) enjeksiyonu ile talamo-kortikal bağlantıları meydana çıkarmak için uygulanabilir olduğunu göstermiştir.
Mini-ozmotik pompası hazırlanmasında, hedef noktası ve aralama kullanımını dikkate için kritik öneme sahiptir. Biz birlikte, 0.9 mm yanal, iğnenin çok uç verilen koordinatlarda ventrikül ile temas (-0.2 mm kuyruktaki bu yolla olduğu gibi 0.5mm 2,5 mm dorso ventral iğnenin uzunluğu azaltmak için bir ayırıcı kullanabilirsiniz Bregma saygı). Derin yapılar Araştırmanın hedefi olan ancak, daha sonra hiçbir pullar ihtiyaç duyulacaktır. Daha harici teslim noktası isteniyorsa Benzer şekilde, (yani., Korteks), daha sonra boşluk diskler gerekli olacaktır. Pompa kafasının çok yakın değildir bu yüzden MM'nin hareketlerini engelleyecektir kateter, yeterince uzun olmalıdırse, aynı zamanda çok uzun zaman olduğu gibi bir kez implante aşırı uzunluğu böylece fare doğal hareketi ile kanül çıkarılması riskini artıran, kateter eğilmesine neden olabilir. Kateterin 2 cm bir bölümü hareketlilik ve implantın stabilitesi (Şekiller 1 ve 2) açısından çok iyi sonuçlar vermektedir. 37 ° CO / N pompanın Kuluçka pompa hemen implantasyon anında beyine ilaç pompalamaya başlamanızı sağlar.
Mini-ozmotik pompa implantasyonu o kafatası düzgün kanül implante önce kurutulur sağlamak için kritik öneme sahiptir. Genellikle kuru kemik neden olacaktır% 70 Etanol ile temizlik, ama sürekli kanama tespit edilmesi halinde, bir cauterizer hafifçe kafatası dokunmadan tamamen kurur. Bu iğne giriş mümkün olduğu kadar dikey ve yavaş olduğundan emin olmak için önemlidir. Pozisyonda, ve tutkal kururken sonra, kanül üstünde parmak yerleştirme ov yanlara hareket etmesini önlerkafatası er. Özel bakım kanül yara ve yerleştirme verilmelidir. Bu kesi tam kafatasının orta hat üzerinde ama biraz sağ tarafında gerçekleştirilmez önemlidir. Yarayı kapatırken insizyon orta hattında yapıldığı takdirde, cilt ve böylece yara açılması riskini artırarak, overstretched olacaktır. Bir tarafa hafifçe kesi yaparak dikiş noktaları kanül en yüksek kesiminde uzak olmasını sağlayacaktır. Sonuç olarak orada dikiş noktaları daha az gerginlik olacak ve yara düzgün iyileşir. Hayvanlar yalnız kafesli ve özellikle implantasyon sonrası ilk 10-15 gün boyunca, her gün kontrol edilmelidir. Yara açılması durumunda, yaralar kısa sürede kapalı olması gerekir. Kanül çıkarılır veya hayvan enfeksiyon sunarsa, deney sonlandırılır için vardır. Kanülün yeniden implantasyonu tavsiye edilmez. Başarılı implantasyon doku reklamın yeterli miktarda kullanmak için çok önemlidirhesive (çok değil!) bu kemik alçaltır ve kanül çıkarılması riskini artırır olarak. Ancak, aynı zamanda kemiğe bağlı kanül tutmayacağını çok az yapıştırıcı kullanılarak. Mini-ozmotik pompalar Çözücü biyolojik olarak uyumlu olan, bu tek sınırlama olarak, maddelerin çeşitli içinde çözülmüş ilaç taşıyabilir. Buna ek olarak, hacim ufak olacak verilen (200 ul), bir deney için gerekli konsantrasyon uygun olup olmadığını tespit olmalı ve pompa içindeki çökelmesine neden olmaz.
Anterograd veya retrograd ya izleyiciler ile izleme Yolu beyin bağlantısı ve plastisite incelemek için çok iyi kurulmuş bir tekniktir. Tek incelemek istediği beyin alanı hedefleme doğruluğunu sağlamak için enjekte dikkatli kullanımı stereotaktik çerçeveler verilmelidir (korteks enjekte ederken, yani korpus kallosum üzerinde enjeksiyon engellemek için).
Tüm cerrahi müdahaleler için ve ağrıyı azaltmak için veinflamasyon, hayvanlar müdahaleden sonra üç gün / kg, günde bir kez 4 mg müdahale ve Caprofen önce 0.1 mg / kg Buprenorfin ile tedavi edilmelidir.
Sonuç olarak, bu yaklaşım, zamanda beyin plastisitesi çalışmalar için uygun olan bir yöntem temsil yaralı beyinde protein ya da farmakolojik bileşiklerin etkisini incelemek için uygun bir araç sağlar.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |