Visualisatie van Chondrocyte Intercalatie en Directional Proliferatie via Zebrabow Klonale Cell Analysis in het Embryonale Meckel's Kraakbeen
Summary
Cel organisatie van craniofaciale botten is al lang de hypothese, maar niet direct zichtbaar. Multispectrale cell labeling en in vivo levende beeldvorming maakt visualisatie van de dynamische cel gedrag in de zebravis onderkaak. Hier hebben we detail het protocol te manipuleren Zebrabow transgene vis en direct waar te nemen cel intercalatie en morfologische veranderingen van chondrocyten in de Meckel's kraakbeen.
Abstract
Ontwikkeling van de gewervelde craniofaciale structuren vereist een nauwkeurige afstemming van de cel migratie, proliferatie, adhesie en differentiatie. Patroonvorming van de Meckel's kraakbeen, een eerste faryngeale boog derivaat, omvat de migratie van craniale neurale (CNC), cellen en de progressieve partitionering, proliferatie en de organisatie van gedifferentieerde chondrocyten. Verschillende studies hebben CNC migratie beschreven in onderkaak morfogenese, maar de details van hoe de chondrocyten organisatie bereiken in de groei en uitbreiding van Meckel kraakbeen blijft onduidelijk. De sox10 beperkte en chemisch geïnduceerde Cre-recombinase gemedieerde recombinatie genereert permutaties van verschillende fluorescerende eiwitten (RFP, YFP en CFP), waardoor een multi-spectrale kenmerken van stamcellen en hun nageslacht, als gevolg van verschillende klonale populaties. Via confocale time-lapse fotografie is het mogelijk om de chondrocyten observeren behaviof tijdens de ontwikkeling van de zebravis Meckel kraakbeen.
Multispectrale cel etikettering kunnen wetenschappers uitbreiding van de Meckel's chondrocyten tonen. Tijdens de uitbreiding fase van het Meckel's kraakbeen, waarbij de onderkaak voorafschaduwing, chondrocyten intercaleren verlenging effect als ze stapelen in een georganiseerde eencellige gelaagde rij. Mislukking van deze georganiseerde intercalerend proces cel uitbreiding bemiddelen biedt de cellulaire mechanistische verklaring voor hypoplastic onderkaak die we waarnemen in de onderkaak misvormingen.
Introduction
Craniofaciale ontwikkeling vereist complexe moleculaire, cellulaire en weefsel interacties naar cel proliferatie, migratie en differentiatie 1,2, 3 rijden. Dit strak gereguleerd en complex proces is onderworpen aan genetische en omgevingsfactoren storingen, zodat craniofaciale misvormingen behoren tot de meest voorkomende geboorte misvormingen 1-9. Terwijl chirurgische ingrepen blijft de steunpilaar van de behandeling van craniofaciale afwijkingen, het begrijpen van de ontwikkeling basis is essentieel voor toekomstige therapieën te innoveren. Daarom is het bestuderen van de morfogenese en de mechanismen van de convergentie en extensie en cellen integratie verschaft nieuwe inzichten in de vorming van het craniofaciale skelet 1.
Craniale neurale lijst migreren en bevolken de eerste faryngeale boog, vormen dan gepaarde onderkaak processen die zich uitstrekken tot de Meckel's kraakbeen, waarbij de onderkaak voorafschaduwing vormen. Morfogenese of de Meckel's kraakbeen vereist chondrocyten organisatie via gerichte proliferatie, cel polarisatie en differentiatie 1,10. De ingewikkeldheid van chondrocyte organisatie in de groei en uitbreiding van Meckel kraakbeen blijft onduidelijk. Inzicht in de dynamische cel gedrag is van cruciaal belang voor het begrijpen van aangeboren afwijkingen van invloed zijn onderkaak grootte, zoals hypoplastic onderkaak fenotypes 11.
Zebravis embryo's bieden vele ontwikkelings-en genetische voordelen voor de gedetailleerde studie van Meckel's kraakbeen morfogenese. Hun genetische traceerbaarheid, transparantie, ex vivo en snelle ontwikkeling zijn krachtige voordelen goed uitlenen voor observatie van de cel beweging en organisatie door het live-imaging 6. Met behulp van lineage tracing hulpmiddelen, zoals sox10: kaede transgene lijn, hebben wij en anderen de neurale oorsprong van de embryonale craniofaciale skelet 1,5 afgebakend. Using de sox10: ERT2-Cre met de Ubi: Zebrabow-M transgene lijn, is het nu mogelijk om de details van cellulaire bewegingen verkennen tijdens craniofaciale ontwikkeling. De Zebrabow-M, is een transgene lijn ontworpen met de ubiquitine promotor die de expressie van verschillende fluoroforen, elk geflankeerd door Lox plaatsen 8. De Zebrabow-M standaard fluorofoor is Rood, uiten RFP. Na inductie van Cre expressie, de Zebrabow-M te construeren recombineert en cellen brengen een combinatie van verschillende fluoroforen (RFP, GVB en YFP) het creëren van multi-spectrale expressie in het embryo. Alle dochtercellen die scheiden van de gemerkte cellen na de recombinatie gebeurtenis worden daarna klonaal gemerkt, zodat celpopulaties die voortkomen uit verschillende naast elkaar geplaatste progenitors klonaal gelabeld. Door deze klonen cel labeling, kunnen cellen proliferatie en migratie klonale resolutie volgen (figuur 1 en 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Alcian blauw en photoconvertible transgene lijnen zoals boven beschreven aanvulling elkaar om het complexe proces van kraakbeen- en botvorming te definiëren. Echter, live cellulaire migratie en organisatie tijdens de organogenese is al lang de hypothese en indirect aangetoond, maar nooit gevisualiseerd. Zebrabow-M transgene lijn in combinatie met een kraakbeen specifieke Cre kan tegelijkertijd live-observatie van al deze verschillende gebeurtenissen die betrokken zijn bij de vorming van bot en kraakbeen. Deze techniek …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Alex Schier voor vriendelijk delen van de Zebrabow-M transgene lijn, Geoffrey Burns voor de pDEST vector en Renee Ethier-Daigle voor een uitstekende verzorging van de vis faciliteit en lijnen.
FINANCIERING:
We zijn dankbaar voor de genereuze financiering steun van NIDCR RO3DE024490 en Shriners Hospitals for Children (ECL) en post-doctorale opleiding beurzen van Shriners Hospitals for Children (LR en YK).
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. . Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
