मूल्यांकन सेल Mechanosensing और Durotaxis के लिए एक सरल प्रणाली<em> इन विट्रो</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
बाह्य मैट्रिक्स की संरचना और यांत्रिक गुणों प्रकार के ऊतकों के बीच अत्यधिक चर रहे हैं। यह संयोजी ऊतक बहुत स्ट्रोमा विविधता प्रभावों सेल व्यवहार सेल प्रसार, भेदभाव, आसंजन संकेतन और दिशात्मक प्रवास सहित सामान्य और वैकृत प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए। इस संबंध में कुछ प्रकार की कोशिकाओं की जन्मजात क्षमता durotaxis के रूप में जाना जाता है एक stiffer, या कम से शिकायत मैट्रिक्स सब्सट्रेट की ओर पलायन करने के लिए। इस घटना भ्रूण विकास, घाव की मरम्मत और कैंसर सेल आक्रमण के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यहाँ, हम polydimethylsiloxane (PDMS) substrates का उपयोग, इन विट्रो में, durotaxis अध्ययन करने के लिए एक सीधा परख का वर्णन है। कक्षों durotaxis वर्णित की तैयारी अपेक्षाकृत नरम PDMS जेल और एक कठोर कांच coverslip के बीच एक कठोरता इंटरफेस बनाता है। दिए गए उदाहरण में, हम Cdc42 के लिए एक भूमिका का प्रदर्शन करने के लिए इन durotaxis कक्षों का इस्तेमाल किया है / Rac1 GTPase को सक्रिय protecdGAP में, mechanosensing और मानव U2OS ऑस्टियो सार्कोमा कोशिकाओं में durotaxis नियमन में। इस परख mechanosignaling और durotaxis में उनके संबंधित भूमिकाओं का पता लगाने के लिए अन्य प्रकार की कोशिकाओं और / या हितों के अन्य प्रोटीन की पछाड़ना के लिए आसानी से अनुकूल है।
Introduction
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोलेजन, फ़ाइब्रोनेक्टिन और laminin सहित संरचनात्मक और तिर्यक प्रोटीन की एक जटिल सरणी के शामिल है। यह अच्छी तरह से ईसीएम सेलुलर ऊतकों के लिए महत्वपूर्ण संरचनात्मक सहायता प्रदान करता है कि स्थापित किया जाता है, कोशिकाओं को सक्रिय सेल अस्तित्व, भेदभाव और सेल प्रवास सहित विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए उनके ईसीएम वातावरण में भौतिक परिवर्तनों का जवाब संकेत मिलता है कि बढ़ती हुई सबूत नहीं है। कड़ी (~ 25 किलो पास्कल) substrates osteogenic भेदभाव 1 को बढ़ावा देने, जबकि उदाहरण के लिए, ईसीएम की कठोरता में मतभेद मुलायम substrates (~ 1 किलो पास्कल) तंत्रिकाजन्य प्रजातियों को बढ़ावा देने के साथ, अलग-अलग प्रजातियों के प्रति mesenchymal स्टेम सेल ड्राइव कर सकते हैं। इसी तरह, स्ट्रोमल मैट्रिक्स कठोरता में वृद्धि आसपास के ऊतकों 2,3 में स्तन उपकला कोशिका tumorigenesis और आक्रमण को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है।
इस mechanosign का एक विशेष रूप से दिलचस्प पहलूकोशिकाओं को एक और अधिक कठोर सब्सट्रेट 4,5 की ओर अधिमान्यतया विस्थापित जिसमें durotaxis, के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में Aling गतिविधि का परिणाम है। कोशिकाओं को लगातार ईसीएम के लिए बाध्य इंटीग्रिन रिसेप्टर के माध्यम से अपने बाह्य वातावरण की शारीरिक विशेषताओं भावना। यह, बारी में, फोकल adhesions या फोकल संपर्कों 6.7 रूप में जाना जाता चिपकने वाला संरचनाओं के गठन ड्राइव करने के लिए उनकी साइटोप्लास्मिक डोमेन के लिए कई संरचनात्मक और संकेत प्रोटीन का संचय को बढ़ावा देता है। Integrins कोई निहित enzymatic गतिविधि है, संकेतों उनके बदलते पर्यावरण से 8 सेल की प्रतिक्रिया समन्वय स्थापित करने के लिए इन गौण प्रोटीन के माध्यम से ईसीएम से रिले किया जाता है। तदनुसार, mechanosignaling और durotaxis विनियमन में शामिल प्रमुख प्रोटीनों की पहचान और लक्षण वर्णन जांच का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है।
विभिन्न मॉडल प्रणाली durotaxis इन विट्रो अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, लेकिन सबसे ज्यादा हैउपयोग किया कोलेजन लेपित polyacrylamide substrates के 4। हालांकि, polyacrylamide substrates की तैयारी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और इन assays में इस्तेमाल कोलेजन सब्सट्रेट से 9 रासायनिक Crosslinked होना चाहिए। Polydimethylsiloxane (PDMS) substrates polyacrylamide substrates के 10 करने के लिए तुलनीय यांत्रिक गुणों का प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, PDMS substrates बस crosslinker के लिए आधार के एक अनुपात मिश्रण से तैयार कर रहे हैं और इन substrates इस प्रकार PDMS सेल व्यवहार पर कठोरता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक आसान उपकरण बनाने, रासायनिक crosslinking के लिए आवश्यकता के बिना ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित किया जा सकता है। इस के साथ साथ, हम एक नरम PDMS सब्सट्रेट एक कठोर गिलास coverslip के साथ एकीकृत है जिसमें एक साधारण durotaxis कक्ष तैयार करने के लिए कैसे का वर्णन है।
परख, नीचे उल्लिखित के रूप में, durotaxis अध्ययन करने के लिए एक त्वरित और आसान तरीका प्रदान करता है। इस अध्ययन के लिए हम siRNA की मध्यस्थता के साथ संयुक्त मानव U2OS ऑस्टियो सार्कोमा कोशिकाओं का इस्तेमाल कियाcdGAP की पछाड़ना durotaxis 11 में इस फोकल आसंजन प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रोटोकॉल तत्काल व्यक्तिगत आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अन्य प्रकार की कोशिकाओं U2OS कोशिकाओं के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है और किसी भी प्रोटीन नीचे गिरा या durotaxis के दौरान सेल व्यवहार पर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए overexpressed जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल उनकी गतिशीलता और व्यवहार का उपयोग FRAP या दृष्टिकोण झल्लाहट का विश्लेषण करने के लिए fluorescently टैग प्रोटीन को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ हम कोशिकाओं पलायन में durotaxis अध्ययन करने के लिए एक सरल परख का वर्णन है। इस परख की एक प्रमुख ताकत PDMS का उपयोग कर durotaxis कक्षों की तैयारी में आसानी है। substrates की कठोरता आसानी से परख में विभिन्न कठोरताओ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच R01 GM47607, CA163296 और सीईटी के लिए NSF 1,334,493 द्वारा समर्थित है। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए टर्नर प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद। इस रिपोर्ट में दिखाए गए सभी डेटा वार्मर एट अल। 2014 11 से अनुमति के द्वारा reproduced किया गया।
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
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