מערכת פשוטה לסלולרי הערכת Mechanosensing וDurotaxis<em> במבחנה</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
מאפייני הרכב ומכאני של מטריקס הם משתנה מאוד בין סוגי רקמות. גיוון זה חיבור סטרומה הרקמה מאוד תא השפעות התנהגות להסדיר תהליכים נורמלים ופתולוגיים כוללים התפשטות תאים, התמיינות, איתות הידבקות והגירה כיוונית. בהקשר זה, היכולת המולדת של סוגים מסוימים של תאים לנדוד לכיוון מצע מטריצה נוקשה, פחות או תואם נקרא durotaxis. תופעה זו ממלאת תפקיד חשוב בהתפתחות עוברית, תיקון פצע ופלישה של תאים סרטניים. כאן אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis, במבחנה, באמצעות polydimethylsiloxane מצעים (PDMS). הכנת תאר durotaxis תאים יוצרת ממשק בין נוקשות ג'ל PDMS הרך יחסית וcoverslip זכוכית נוקשה. בדוגמא בתנאי, השתמשנו תאי durotaxis אלה להפגין תפקיד לCdc42 הגנה של מחזור / Rac1 GTPase הפעלהב, cdGAP, בmechanosensing וdurotaxis רגולציה בתאי אוסטאוסרקומה U2OS אנושיים. assay זה הוא בקלות להתאמה לסוגי תאים אחרים ו / או מציאה של חלבונים אחרים של אינטרסים לחקור התפקידים שלהם בmechanosignaling וdurotaxis.
Introduction
מטריקס (ECM) מורכב ממערך מורכב של חלבונים מבניים וcrosslinking כולל קולגן, פיברונקטין וlaminin. למרות שזה מבוסס היטב כי ECM מספק תמיכה מבנית חשובה לרקמות סלולריות, יש ראיות גוברים למצביעות על כך שתאים באופן פעיל להגיב לשינויים פיזיים בסביבת ECM להסדיר תהליכים תאיים שונים כולל הישרדות תא, התמיינות ונדידת תאים. לדוגמא, הבדלים בקשיחות של ECM יכולים לנהוג בתאי גזע mesenchymal כלפי שושלות שונות, עם מצעים רכים (~ 1 kPa) קידום שושלות עצביות בעוד מצעים נוקשה (~ 25 kPa) לקדם בידול osteogenic 1. כמו כן, עלייה בקשיחות מטריצת סטרומה הוכחה לקדם tumorigenesis החלב אפיתל תאים ופלישה ל2,3 הרקמה הסובב.
היבט מעניין במיוחד של mechanosign זהתוצאות פעילות aling בתהליך המכונה durotaxis, שבו תאים לנדוד מועדף כלפי מצע קשיח יותר 4,5. תאים לחוש כל הזמן את המאפיינים הפיזיים של הסביבה תאית שלהם באמצעות קולט integrin מחייבים את ECM. זה, בתורו, מקדם את ההצטברות של חלבונים מבניים ואיתות רבים לתחומים cytoplasmic לנהוג ההיווצרות של מבנים דבקים הידועים כהידבקויות מוקד או אנשי קשר מוקדי 6,7. מאז יש לי integrins אין פעילות האנזימטית טבועה, אותות מועברים מECM דרך חלבוני אבזר אלה כדי לתאם את התגובה של התא לסביבה המשתנה שלהם 8. בהתאם לכך, זיהוי והאפיון של חלבוני מפתח מעורבים בויסות mechanosignaling וdurotaxis הוא אזור חשוב של חקירה.
מערכות מודל שונות פותחו כדי ללמוד durotaxis במבחנה, אך רוב יש לימצעים מנוצלים מצופה קולגן polyacrylamide 4. עם זאת, ההכנה של מצעי polyacrylamide יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית וקולגן המשמש במבחנים אלה חייב להיות כימיים crosslinked למצע 9. Polydimethylsiloxane מצעים (PDMS) הוכחו תערוכה תכונות מכאניות דומות למצעי polyacrylamide 10. עם זאת, מצעי PDMS מוכנים על ידי ערבוב פשוט יחס של הבסיס לcrosslinker ויכולים להיות מצופים מצעים אלה עם חלבוני ECM ללא הצורך בcrosslinking הכימי, ובכך PDMS כלי קל יותר לחקור את ההשפעות של נוקשות בהתנהגות תא. בזאת, אנו מתארים כיצד להכין קאמרי durotaxis פשוט שבמצע PDMS רך משולב עם coverslip זכוכית נוקשה.
Assay, כמפורט להלן, מספק שיטה מהירה ופשוטה ללמוד durotaxis. במחקר זה השתמשנו בתאים אנושיים אוסטאוסרקומה U2OS בשילוב עם תיווך siRNAמציאה של cdGAP כדי ללמוד את התפקיד של חלבון הידבקות מוקד זה בdurotaxis 11. חשוב לציין, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לדרישות פרט. סוגי תאים אחרים יכולים להחליף את תאי U2OS וכל חלבון יכול להיות הפיל או ביטוי יתר כדי לקבוע את ההשפעות על התנהגות תא במהלך durotaxis. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשלב חלבונים מתויגים fluorescently לנתח את הדינמיקה שלהם וFRAP באמצעות התנהגות או סריג גישות.
Protocol
Representative Results
Discussion
במסמך זה אנו מתארים assay פשוט ללמוד durotaxis בתאים נודדים. כוח עיקרי של assay זה הוא הקלות של הכנת תאי durotaxis באמצעות PDMS. הנוקשות של מצעים ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי היחס של פתרון בסיס PDMS לcrosslinker כדי לאפשר המחקר של קשיחויות שונות בassay. עם זאת, הגבלת פוטנציאל אחד של המערכת היא …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי NIH R01 GM47607, CA163296 וNSF 1,334,493 למטח. אנו מודים לחברי המעבדה טרנר לקריאה ביקורתית של כתב היד. כל הנתונים שמוצגים בדוח זה היו מיוצרים באישור וורמר et al. 2,014 11.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
- Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
- Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
- Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
- Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).
