Un système simplifié pour la cellule évaluation mechanosensing et durotaxis<em> In Vitro</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
Les propriétés mécaniques et la composition de la matrice extracellulaire sont très variables entre les différents types de tissus. Cette diversité de stroma de tissu conjonctif considérablement le comportement des cellules des impacts pour réguler les processus normaux et pathologiques, y compris la prolifération cellulaire, la différenciation, la signalisation de l'adhésion et la migration directionnelle. À cet égard, la capacité innée de certains types de cellules de migrer vers un substrat rigide, ou moins conforme matrice est appelée durotaxis. Ce phénomène joue un rôle important au cours du développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies et l'invasion des cellules cancéreuses. Ici, nous décrivons un test simple à étudier durotaxis, in vitro, utilisant polydiméthylsiloxane (PDMS) substrats. Préparation de la durotaxis décrit chambres crée une interface entre la rigidité du gel de PDMS relativement mou et une lamelle de verre rigide. Dans l'exemple fourni, nous avons utilisé ces durotaxis chambres de démontrer un rôle pour le cdc42 / Rac1 activation GTPase protedans, cdGAP, dans les mécanorécepteurs et durotaxis la réglementation dans les cellules d'ostéosarcome humain U2OS. Ce test est facilement adaptable à d'autres types et / ou knockdown d'autres protéines cellulaires d'intérêt à explorer leurs rôles respectifs dans mechanosignaling et durotaxis.
Introduction
La matrice extracellulaire (ECM) est constitué d'un ensemble complexe de protéines de structure de réticulation et y compris le collagène, la fibronectine et la laminine. Bien qu'il soit bien établi que l'ECM fournit un soutien structurel important pour les tissus cellulaires, il est de plus en plus de preuves pour indiquer que les cellules réagissent activement aux changements physiques de leur environnement ECM pour réguler divers processus cellulaires, y compris la survie cellulaire, la différenciation et la migration cellulaire. Par exemple, les différences dans la rigidité de l'ECM peuvent conduire les cellules souches mésenchymateuses vers différentes lignées, avec des substrats souples (~ 1 kPa) promotion lignées neurogéniques tout raides (~ 25 kPa) substrats favorisent la différenciation ostéogénique 1. De même, a montré une augmentation de la rigidité de la matrice du stroma, de promouvoir la tumorigenèse mammaire de cellules épithéliales et dans l'invasion des tissus environnants 2,3.
Un aspect particulièrement intéressant de la présente mechanosignrésultats de l'activité de aling dans un processus connu sous le nom durotaxis, dans lequel les cellules migrent préférentiellement vers un substrat plus rigide. 4,5 Les cellules détectent en permanence les caractéristiques physiques de leur environnement extracellulaire par récepteur d'intégrine de liaison à l'ECM. Ceci, à son tour, favorise l'accumulation de nombreuses protéines de structure et de signalisation de leurs domaines cytoplasmiques pour entraîner la formation de structures adhésives connues sous le nom adhésions focales focales ou des contacts 6,7. Depuis intégrines ont pas d'activité enzymatique inhérente, les signaux sont relayés de l'ECM à travers ces protéines accessoires pour coordonner la réponse de la cellule à leur environnement changeant 8. En conséquence, l'identification et la caractérisation des protéines clés impliquées dans la régulation mechanosignaling et durotaxis est un domaine de recherche important.
Différents systèmes de modèles ont été mis au point pour étudier durotaxis in vitro, mais la plupart ontutilisés substrats de Polyacrylamide enrobé de collagène 4. Cependant, la préparation des substrats de Polyacrylamide peut être techniquement difficile et le collagène utilisé dans ces essais doit être chimiquement réticulé sur le substrat neuf. Polydiméthylsiloxane (PDMS) substrats se sont révélés présenter des propriétés mécaniques comparables aux substrats de Polyacrylamide à 10. Toutefois, les substrats PDMS sont préparées en mélangeant simplement un rapport de la base pour agent de réticulation et de ces substrats peuvent être revêtus avec des protéines d'ECM sans la nécessité d'une reticulation chimique, ce qui rend PDMS un outil plus facile à étudier les effets de la rigidité sur le comportement de la cellule. Ici, nous décrivons comment préparer une chambre de durotaxis simple dans lequel un substrat de PDMS souple est intégré avec une lamelle de verre rigide.
L'essai, comme indiqué ci-dessous, fournit une méthode simple et rapide pour étudier durotaxis. Pour cette étude, nous avons utilisé des cellules d'ostéosarcome de U2OS humaines combinées avec le siRNA médiationknockdown de cdGAP pour étudier le rôle de cette protéine d'adhésion focale dans durotaxis 11. Surtout, ce protocole peut être facilement adapté aux besoins individuels. Autres types de cellules peuvent être substitués pour les cellules U2OS et toute protéine peuvent être renversés ou surexprimés pour déterminer les effets sur le comportement des cellules pendant durotaxis. En outre, ce protocole peut être adapté pour incorporer des protéines par fluorescence marqués d'analyser leur dynamique et leur comportement à l'aide FRAP ou FRET approches.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons un test simple pour étudier durotaxis dans les cellules de la migration. Une des grandes forces de ce test est la facilité de préparation des chambres de durotaxis utilisant PDMS. La rigidité des substrats peut être facilement manipulé en changeant le rapport de la solution de base PDMS agent de reticulation afin de permettre l'étude des diverses rigidités dans le dosage. Cependant, une limitation potentielle du système est que les cellules ne sont exposés à un seul changement de rigi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par le NIH R01 GM47607, CA163296 et NSF 1.334.493 de CET. Nous remercions les membres du laboratoire Turner pour une lecture critique du manuscrit. Toutes les données présentées dans ce rapport ont été reproduits avec l'autorisation de Wormer et al. 2014 11.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
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