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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Vacuolar बनाम साइटोसोलिक की मात्रा का ठहराव Published: July 28, 2015 doi: 10.3791/52960
Automatic Translation
1, 1
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

Abstract

Intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों cytosol में या विशेष रोगज़नक़ युक्त रिक्तिकाएं (PCVs) में नकल कर सकते हैं। साइटोसॉल तक पहुंचने के लिए, शिगेला flexneri और Francisella novicida जैसे बैक्टीरिया फेगोसोम का टूटना को प्रेरित करने की आवश्यकता है। इसके विपरीत, साल्मोनेला साल्मोनेला युक्त रिक्तिका (SCV) के रूप में जाना जाता है एक vacuolar डिब्बे में replicates। साल्मोनेला की हालांकि कुछ म्यूटेंट SCV अखंडता बनाए रखने में विफल है और इस तरह साइटोसॉल में जारी किए हैं। एकल बैक्टीरिया के स्तर पर vacuolar बैक्टीरिया बनाम साइटोसोलिक का प्रतिशत भी फेगोसोम-संरक्षण परख के रूप में जाना जाता है, अंतर permeabilization के द्वारा मापा जा सकता है। दृष्टिकोण डिटर्जेंट digitonin की संपत्ति के उपयोग चुनिंदा कोलेस्ट्रॉल बाध्य करने के लिए बनाता है। प्लाज्मा झिल्ली अन्य सेलुलर झिल्ली की तुलना में अधिक कोलेस्ट्रॉल होता है, digitonin इंट्रासेल्युलर झिल्ली जा रही है जबकि चुनिंदा प्लाज्मा झिल्ली permeabilize के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैबरकरार। एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर (दूसरों के बीच जैसे mCherry) व्यक्त रोगज़नक़ के साथ संक्षिप्त, निम्नलिखित संक्रमण में, मेजबान कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली बफर युक्त digitonin में एक छोटी ऊष्मायन के साथ permeabilized है। कोशिकाओं तो धोया और incubated पसंद के जीवाणु के खिलाफ निर्देशित (पसंद का एक फ्लोरोफोरे करने के लिए मिलकर) एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ (जैसे विरोधी साल्मोनेला -FITC) और फिर से धोया जाता है। अगोचर बैक्टीरिया का इस्तेमाल किया जाता है, तो एक अतिरिक्त कदम जिसमें सभी झिल्ली permeabilized कर रहे हैं और सभी बैक्टीरिया एक इसी एंटीबॉडी के साथ दाग, किया जा सकता है। धुंधला के बाद, vacuolar और साइटोसोलिक बैक्टीरिया का प्रतिशत एकल या डबल सकारात्मक घटनाओं की गणना के द्वारा FACS या माइक्रोस्कोपी द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। यहाँ हम जीवाणु साल्मोनेला के साथ इस तकनीक के इस्तेमाल के लिए प्रयोगात्मक जानकारी प्रदान करते हैं। इस परख का लाभ अन्य परख के विपरीत, यह एक bacte के स्तर पर एक मात्रा का ठहराव प्रदान करता है, वह यह है किरिया, माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया है और अगर किसी दिए गए सेल में साइटोसोलिक और vacuolar बैक्टीरिया की सही संख्या प्रदान करता है।

Introduction

Intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों सीधे मेजबान सेल cytosol में, या विशेष vacuolar डिब्बों 1 में या तो दोहराने। संक्रमण के प्रारंभिक चरण के दौरान सबसे रोगजनकों (जैसे मैक्रोफेज के रूप में) या सक्रिय रूप से गैर-phagocytic कोशिकाओं में अपने स्वयं के तेज बढ़ावा देने के द्वारा विशेष कोशिकाओं द्वारा phagocytosis द्वारा या तो भली भाँति मिलता है। Phagocytic कोशिकाओं में, फेगोसोम सामान्य रूप से phagocytosed कणों से पच जाता है जहां एक degradative डिब्बे, के लिए फार्म लाइसोसोम के साथ फ़्यूज़। ऐसे Francisella novicida या शिगेला flexneri के रूप में विशिष्ट साइटोसोलिक बैक्टीरिया, फेगोसोम का टूटना उत्प्रेरण द्वारा phagosomal गिरावट बचने के लिए और बाद में साइटोसॉल 2,3 में भाग जाते हैं। यह एक ऐसी vacuolar टूटना 2-4 का प्रचार करने वाले प्रेरक प्रोटीन injects जो Francisella pathogenicity द्वीप (FPI) या शिगेला flexneri T3SS, के रूप में डाह से जुड़े तंत्र की आवश्यकता है। मेजबान सेल साइटोसॉल सुविधाओंसामान्य रूप से रोगाणुओं की उपस्थिति को समझते हैं और 5 संकेत सहज प्रतिरक्षा को प्रेरित है कि संरक्षित पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स की संख्या। इसके अलावा, xenophagy, भोजी की एक एंटी-माइक्रोबियल फार्म साइटोसॉल दर्ज बैक्टीरिया है कि नीचा कर सकते हैं। साइटोसोलिक बैक्टीरिया आम तौर पर अच्छी तरह से कुंद या अलग अलग रणनीतियों का उपयोग कर इन प्रतिक्रियाओं को नाकाम करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, Francisella मेजबान मान्यता से बचने के लिए अपने एलपीएस को संशोधित और शिगेला स्रावित प्रेरक प्रोटीन 6,7 का उपयोग कर भोजी भर्ती रोकता है।

लाइसोसोमल गिरावट से बचने के लिए एक और रणनीति मॉडल vacuolar रोगज़नक़ साल्मोनेला enterica serovar Typhimurium द्वारा नियोजित है, उसके बाद साल्मोनेला के रूप में भेजा। साल्मोनेला अपने इंट्रासेल्युलर आला में प्रारंभिक फेगोसोम फिर से तैयार है कि प्रभावोत्पादक इंजेक्षन करने के लिए एक T3SS का उपयोग करता है, साल्मोनेला रिक्तिका (SCV) युक्त 8,9। मेजबान रास्ते में से सतत हेरफेर हैआवश्यक रिक्तिका के लिए लिपिड और अन्य पोषक तत्वों की भर्ती करके इस रिक्तिका बनाए रखने के लिए। दरअसल, साल्मोनेला के Sifa उत्परिवर्ती vacuolar स्थिरता बनाए रखने में विफल रहता है, और सहज प्रतिरक्षा रास्ते और भोजी भर्ती 8 की सक्रियता में जो परिणाम के संक्रमण के बाद घंटे के भीतर मेजबान कोशिकाओं के साइटोसॉल, प्रवेश करती है। साल्मोनेला की vacuolar भागने के अध्ययन है कि सेल के प्रकार पर निर्भर करता है, और कई रिपोर्टों उपकला कोशिकाओं में भी गुम्मट साल्मोनेला साइटोसॉल 10 में SCV और hyperreplicate बच सकते हैं कि पता चला है। हाल ही में रिपोर्ट vacuolar रोगाणुओं की सहज प्रतिरक्षा का पता लगाने को भी समझते हैं और रोगज़नक़ युक्त रिक्तिकाएं (PCVs) 11-14 को अस्थिर करने के लिए मेजबान की क्षमता पर निर्भर करता है कि पता चलता है।

मेजबान या बैक्टीरिया दोनों जीनोटाइप vacuolar और साइटोसोलिक डिब्बे के बीच इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के वितरण को प्रभावित कर सकते हैं कि यह देखते हुए, यह vacuolar बनाम की संख्या यों के लिए आवश्यक हैसाइटोसोलिक बैक्टीरिया। के बाद से सबसे अधिक प्रयोगात्मक setups में मेजबान कोशिकाओं अलग subcellular डिब्बों में कई बैक्टीरिया बंदरगाह कर सकते हैं बाद में एक से अधिक जीवाणु से संक्रमित है, और कर रहे हैं, एक तकनीक एकल बैक्टीरिया के स्तर पर मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है कि जरूरत है। (यह भी phagosomal संरक्षण परख के रूप में जाना जाता है) विभेदक permeabilization के इस संकल्प 2,4,10,12 प्रदान करता है। परख बरकरार vacuolar झिल्ली जो पत्ते डिटर्जेंट digitonin, साथ मेजबान सेल प्लाज्मा झिल्ली के चुनिंदा permeabilization पर आधारित है और इस प्रकार एंटीबॉडी के साथ साइटोसोलिक बैक्टीरिया के चुनिंदा धुंधला की अनुमति देता है। यहाँ हम अंतर permeabilization का उपयोग कर साइटोसोलिक और vacuolar साल्मोनेला की मात्रा का ठहराव के लिए दो प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस पद्धति के सिद्धांत चित्र 1 में वर्णित है: अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) स्थिर चरण साल्मोनेला mCherry व्यक्त से संक्रमित हैं। स्थिर चरण साल्मोनेला टी की जरूरतवे गतिविधि जिसका अन्यथा NLRC4 inflammasome द्वारा मान्यता प्राप्त है और BMDMs 15 का तेजी से कोशिका मृत्यु (pyroptosis) के लिए प्रेरित किया जाएगा SPI-1 T3SS, की अभिव्यक्ति downregulate क्योंकि ओ इस्तेमाल किया जाएगा। कोशिकाओं को धोया और 1 मिनट के लिए digitonin के 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ व्यवहार कर रहे हैं संक्रमण के बाद। कोशिकाओं तुरंत फिर से धोया और साइटोसॉल के उपयोग के साथ बैक्टीरिया चिह्नित करने के लिए FITC के लिए युग्मित विरोधी साल्मोनेला एंटीबॉडी के साथ incubated हैं। कदम कोशिकाओं lysed रहे हैं एक अतिरिक्त धोने और mCherry (+ vacuolar) और FITC / + mCherry (+ साइटोसोलिक) बैक्टीरिया का प्रतिशत के बाद FACS द्वारा निर्धारित किया जाता है। हम भी कोई फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त उपभेदों उपलब्ध (चित्रा 2) कर रहे हैं इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस विधि के एक अनुकूलन रिपोर्ट। अतिरिक्त चरणों कोशिकाओं तय की और पूरी तरह से permeabilized कर रहे हैं, जिसमें FITC लेबलिंग के बाद पेश कर रहे हैं। इसके बाद सभी बैक्टीरिया विरोधी साल्मोनेला एंटीबॉडी और इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं। डेटection तो बजाय FACS विश्लेषण के माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जाता है।

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Protocol

साल्मोनेला mCherry व्यक्त के साथ 1. Digitonin परख (विश्लेषण FACS-आधारित)

  1. तैयार हो रहा है बैक्टीरिया
    नोट: एक प्लाज्मिड (pFPV rpsM प्रमोटर के तहत mCherry एन्कोडिंग) से mCherry व्यक्त साल्मोनेला जंगली प्रकार SL1344 (स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी) इस परख में प्रयोग किया जाता है। MCherry के विधान अभिव्यक्ति द्वारा बदला नहीं जहां बैक्टीरियल phagocytosis और प्रसार 16 (डेटा) नहीं दिखाया।
    1. 37 डिग्री सीओ / एन में एक प्रकार के बरतन में स्ट्रेप्टोमाइसिन (90 माइक्रोग्राम / एमएल) और एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल, mCherry व्यक्त वेक्टर) के साथ पूरक लेग मध्यम के 3 मिलीलीटर में संक्रमण से पहले तनाव 1 दिन टीका लगाना।
  2. संक्रमण के लिए कोशिकाओं चढ़ाना।
    1. 1.25 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर एक 24 अच्छी तरह से थाली में बीज जंगली प्रकार BMDMs / अच्छी तरह से प्राथमिक बृहतभक्षककोशिका माध्यम से 1 मिलीलीटर में (DMEM 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस, गर्मी निष्क्रिय, 56 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के साथ पूरक ), 1% HEPES, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 1% एल Glutamine और 10% L929 सतह पर तैरनेवाला (बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ से वातानुकूलित माध्यम) L929 कोशिकाओं के निर्माण)। 1 टेबल के अनुसार बीज कुओं व्यक्तिगत स्थितियों के लिए खाते। नियंत्रण (तालिका 1) के रूप में इस्तेमाल किया वेल्स को coverslips जोड़ें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में रातोंरात कोशिकाओं को सेते हैं और 5% सीओ 2।
Permeabilization धुंधला हो जाना
कांच coverslip साल्मोनेला Digitonin Saponin विरोधी साल्मोनेला विरोधी Calnexin विरोधी पीडीआई
ए 1 (नमूना) - + / * + + +
ए 2 (नमूना) - + / * + + +
ए 3 (नमूना) - + / * + + +
ए 4 (कोई permeabilization के नियंत्रण) - + / * + +
उ 5 (पूरा permeabilization के नियंत्रण) - + / * + + +
बी 1 (calnexin के लिए दाग) + +
बी 2 (calnexin के लिए दाग) + + +
बी 3 (calnexin के लिए दाग) + + +
सी 1 (दाग) पीडीआई के लिए + +
सी 2 (पीडीआई के लिए दाग) + + +
सी 3 (पीडीआई के लिए दाग) + + +

तालिका 1: साल्मोनेला, permeabilization, और धुंधला के साथ बाद में संक्रमण के लिए 24 अच्छी तरह प्रारूप में अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDMs) के लिए चढ़ाना योजना * प्रोटोकॉल 1 या 2 प्रोटोकॉल किया जाता है कि क्या पर निर्भर करता है।।

  1. संक्रमण के लिए बैक्टीरिया तैयार कर रहा है।
    1. अगले दिन, पीबीएस में संस्कृति 01:10 गिराए और एक पीबीएस केवल नियंत्रण के खिलाफ 600 आयुध डिपो को मापने के द्वारा रातोंरात संस्कृति में साल्मोनेला की एकाग्रता का निर्धारण। इस ओवर ड्राफ्ट 600 एल में मापा जाता है सुनिश्चित करता है किस्पेक्ट्रोफोटोमीटर के inear सीमा होती है।
    2. मिलीलीटर प्रति साल्मोनेला की एकाग्रता की गणना। 1 के एक OD600 1 एक्स 10 9 बैक्टीरिया से मेल खाती है।
    3. 1.25 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक साल्मोनेला एकाग्रता तक पहुँचने के लिए बृहतभक्षककोशिका माध्यम में बैक्टीरिया पतला।
  2. साल्मोनेला के साथ कोशिकाओं के संक्रमण।
    1. BMDMs से मध्यम निकालें। असंक्रमित नियंत्रण कुओं (बी 1-बी 3, सी 1-सी 3) को बृहतभक्षककोशिका माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें। कुओं A1 के लिए साल्मोनेला निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें - उ 5 सेल 10 प्रतिशत बैक्टीरिया का संक्रमण (MOI) की बहुलता तक पहुँचने के लिए।
    2. संक्रमण सिंक्रनाइज़ करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 300 XG पर 15 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में थाली स्थानांतरण और 5% सीओ 2।
  3. Gentamicin साथ कोशिकी साल्मोनेला हत्या।
    1. 1 घंटे के बाद संक्रमण से कम, इनक्यूबेटर से थाली निकालें और 0.1 मिलीग्राम / एमएल Gentamicin युक्त बृहतभक्षककोशिका माध्यम की 0.1 मिलीलीटर जोड़नेकोशिकी बैक्टीरिया को मारने के लिए। सभी कोशिकाओं को एक ही तरह से व्यवहार कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए, यहां तक ​​कि असंक्रमित नियंत्रण करने के लिए, सभी कुओं को Gentamicin जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में थाली स्थानांतरण और 5% सीओ 2।
  4. कोशिकाओं वॉशिंग।
    1. 2 घंटे के बाद संक्रमण से कम, इनक्यूबेटर से थाली निकालें और सभी कुओं सादे DMEM के 1 मिलीलीटर के साथ 2x धो (पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस) और मैक्रोफेज मध्यम के साथ की जगह 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर युक्त (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म)   Gentamycin किसी भी शेष कोशिकी बैक्टीरिया की वृद्धि को रोकने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में थाली स्थानांतरण और 5% सीओ 2।
  5. डिटर्जेंट और एंटीबॉडी के साथ ताजा बफ़र्स तैयार कर रहा है।
    1. बस विश्लेषण के वांछित समय बिंदु से पहले, 1 मिलीग्राम / KHM बफर में मिलीलीटर (110 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 20 मिमी HEPES, 2 मिमी 2 MgCl, पीएच 7.3) पर digitonin के एक ताजा स्टॉक समाधान तैयार है। एक काम एकाग्रता के लिए बफर स्टॉक फ़िल्टर और KHM में पतलाdigitonin के 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर की। इसके अलावा, KHM बफर, KHM में 1/100 में 1/100 या विरोधी पीडीआई में 1/500, विरोधी calnexin पर FITC (सीएसए-1-FITC) के लिए युग्मित विरोधी साल्मोनेला एंटीबॉडी में 0.1% सैपोनिन के समाधान तैयार बफर 3% BSA के साथ पूरक।
  6. सेल permeabilization के।
    1. इनक्यूबेटर से थाली निकालें और धोने के कुओं KHM बफर के 0.5 मिलीलीटर के साथ (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म) 3x। A3 और कुओं A5 और बी 3 के लिए सैपोनिन साथ बी 2 / सी 2 या KHM बफर / सी 3 (1 टेबल के अनुसार) - KHM बफर निकालें और कुओं A1 के लिए digitonin के साथ कुओं ए 4 और बी 1 / सी 1, KHM बफर करने के लिए 0.25 मिलीलीटर सादे KHM बफर जोड़ें। सभी कुओं KHM बफर के 0.5 मिलीलीटर के साथ 3x धो तुरंत आरटी पर बिल्कुल 1 मिनट के लिए सेते हैं और (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म)।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला।
    1. उपयुक्त वेल्स को प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (बकरी विरोधी साल्मोनेला -FITC, 250 μl / अच्छी तरह से, 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) KHM बफर निकालें और जोड़ (चित्रा 1 1 टेबल)। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 15 मिनट के लिए थाली सेते हैं और 5% सीओ 2।
    2. 1 एमएल पीबीएस के साथ 1x कोशिकाओं को धो लें।
  8. संक्रमित कोशिकाओं (कुओं A1: - उ 5): FACS विश्लेषण
    1. धो कोशिकाओं पीबीएस के साथ 3x और 0.1% ट्राइटन युक्त ठंडा पीबीएस के 0.5 एमएल जोड़ने। सेल समुच्चय को तोड़ने के लिए सेल झरनी टोपी के साथ एक 5 एमएल FACS ट्यूब पर स्थानांतरण। बर्फ पर नमूने रखें।
    2. एक FACS के नमूनों का विश्लेषण करें। पूरी तरह से permeabilized नियंत्रण का प्रयोग, कुल आगे के आधार पर बैक्टीरिया और पहले पक्ष तितर बितर (एफएससी / एसएससी) के लिए गेट सेट, और mCherry संकेत (610 एनएम ± 20 एनएम फिल्टर)।
    3. अगला, साइटोसोलिक बैक्टीरिया के लिए द्वार (FITC + mCherry +) और vacuolar बैक्टीरिया (FITC-, mCherry +) (चित्रा 3) स्थापित करने के लिए पूरी तरह से permeabilized और नहीं permeabilized नियंत्रण का उपयोग कर कुल बैक्टीरियल आबादी में FITC के संकेत का विश्लेषण।
    4. फाटक सेट के साथ नमूनों का विश्लेषण और साइटोसोलिक बनाम का प्रतिशत निर्धारितनिर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार FlowJo सॉफ्टवेयर का उपयोग कर vacuolar बैक्टीरिया।
  9. असंक्रमित permeabilization के नियंत्रण (कुओं बी 1 - बी 3, सी 1 - सी 3): माइक्रोस्कोपी
    1. फिक्सेशन
      1. पीबीएस निकालें और पीबीएस में पीएफए ​​4% की 250 μl जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
      2. कुओं पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ 2x धो लें और लगानेवाला बुझाने के लिए 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1 एम ग्लाइसिन के 250 μl जोड़ें। धो कुओं पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ 2x।
    2. माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला।
      1. पीबीएस में fluorophores के लिए युग्मित उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए दाग permeabilization के नियंत्रण में 0.1% सैपोनिन और 3% बीएसए को पूरी तरह से Permeabilize कोशिकाओं के साथ पूरक।
      2. धो पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ 3x coverslips और DAPI (1.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ बढ़ते मध्यम में विश्लेषण के लिए coverslips माउंट।
    3. माइक्रोस्कोपी विश्लेषण।
      1. एक confocal Fluo का उपयोग कर एक 40x या 63x बढ़ाई पर नियंत्रण के साथ coverslips का विश्लेषण करेंrescence माइक्रोस्कोप। Permeabilization के लिए काम किया है, तो digitonin- और Saponin-permeabilized कोशिकाओं और पीडीआई सैपोनिन-permeabilized कोशिकाओं (चित्रा 4) के लिए केवल धुंधला दोनों के लिए कोई गैर permeabilized कोशिकाओं के लिए धुंधला हो जाना, Calnexin धुंधला होना चाहिए।

लेबल न किए गए साल्मोनेला (माइक्रोस्कोपी के विश्लेषण पर आधारित) के साथ 2. Digitonin परख

  1. हे / एन संस्कृतियों के लिए बैक्टीरिया तैयार कर रहा है।
    1. Unlabeled साल्मोनेला जंगली प्रकार SL1344 टीका लगाना (स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी) 37 डिग्री सीओ / एन में एक प्रकार के बरतन में स्ट्रेप्टोमाइसिन (90 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक लेग मध्यम के 3 मिलीलीटर में संक्रमण से पहले 1 दिन।
    2. संक्रमण के लिए कोशिकाओं चढ़ाना।
      1. 1.25 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर बाँझ कांच coverslips युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली में बीज BMDMs / अच्छी तरह से मैक्रोफेज माध्यम से 1 मिलीलीटर (DMEM, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस के साथ डी-पूरित, 56 डिग्री सेल्सियस के पूरक में,30 मिनट), 1% HEPES, 1% एल गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), 1% एल Glutamine और 10% L929 सतह पर तैरनेवाला)। 1 टेबल के अनुसार बीज कुओं व्यक्तिगत स्थितियों के लिए खाते।
      2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं हे / एन सेते हैं और 5% सीओ 2।
    3. संक्रमण के लिए बैक्टीरिया तैयार कर रहा है।
      1. अगले दिन, पीबीएस में संस्कृति 01:10 गिराए और एक पीबीएस केवल नियंत्रण के खिलाफ 600 आयुध डिपो को मापने के द्वारा हे / एन संस्कृति में साल्मोनेला की एकाग्रता का निर्धारण। इस ओवर ड्राफ्ट 600 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रैखिक सीमा में मापा जाता है कि यह सुनिश्चित करता है।
      2. मिली लीटर प्रति साल्मोनेला की एकाग्रता का निर्धारण। 1 के एक आयुध डिपो 600 1 एक्स 10 9 बैक्टीरिया से मेल खाती है।
      3. 1.25 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक साल्मोनेला एकाग्रता तक पहुँचने के लिए बृहतभक्षककोशिका माध्यम में बैक्टीरिया पतला।
    4. साल्मोनेला के साथ कोशिकाओं के संक्रमण। सभी कुओं से मध्यम निकालें। असंक्रमित नियंत्रण वेल्स को सादे बृहतभक्षककोशिका माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें (बी 1 - बी 3, सी 1 - सी 3)। कुओं A1 के लिए साल्मोनेला निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें - उ 5 सेल 10 प्रतिशत बैक्टीरिया का संक्रमण (MOI) की बहुलता तक पहुँचने के लिए।
    5. संक्रमण सिंक्रनाइज़ करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 300 XG पर 15 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में थाली स्थानांतरण और 5% सीओ 2।
  2. Gentamycin साथ कोशिकी साल्मोनेला हत्या।
    1. 1 घंटे के बाद संक्रमण से कम, इनक्यूबेटर से थाली निकालें और सभी कुओं को कोशिकी बैक्टीरिया को मारने के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल Gentamycin युक्त बृहतभक्षककोशिका माध्यम की 0.1 मिलीलीटर जोड़ने। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में थाली स्थानांतरण और 5% सीओ 2।
  3. कोशिकाओं वॉशिंग।
    1. 2 घंटे के बाद संक्रमण से कम, इनक्यूबेटर से थाली निकालें और 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर युक्त ताजा बृहतभक्षककोशिका माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धो 3x को रोकने के लिए Gentamycinकिसी भी शेष कोशिकी जीवाणुओं के विकास। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में थाली स्थानांतरण और 5% सीओ 2।
  4. डिटर्जेंट और एंटीबॉडी के साथ ताजा बफ़र्स तैयार कर रहा है।
    1. बस विश्लेषण के वांछित समय बिंदु से पहले, 1 मिलीग्राम / KHM बफर में मिलीलीटर (110 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 20 मिमी HEPES, 2 मिमी 2 MgCl, पीएच 7.3) पर digitonin के एक ताजा स्टॉक समाधान तैयार है। शेयर फिल्टर और 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक काम एकाग्रता के लिए KHM बफर में पतला digitonin की।
    2. इसके अलावा, KHM बफर में 0.1% सैपोनिन के समाधान तैयार, विरोधी साल्मोनेला -FITC (सीएसए-1, 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल), KHM बफर में 1/100 में 1/100 या विरोधी PDI पर विरोधी calnexin के साथ पूरक 3% बीएसए (एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए सामग्री तालिका देखें)।
  5. सेल permeabilization के।
    1. इनक्यूबेटर से थाली निकालें और धोने के कुओं KHM बफर के 0.5 मिलीलीटर के साथ (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म) 3x। KHM बफर निकालें और 0.25 मिलीग्राम सादे KHM बफर जोड़नेकुओं A1 के लिए digitonin के साथ कुओं ए 4 और बी 1 / सी 1, KHM बफर करने के लिए - A3 और बी 2 / सैपोनिन साथ सी 2 या KHM बफर कुओं A5 और बी 3 के लिए / सी 3 (1 टेबल के अनुसार)। सभी कुओं KHM बफर के 0.5 मिलीलीटर के साथ 3x धो तुरंत आरटी पर बिल्कुल 1 मिनट के लिए सेते हैं और (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म)।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला।
    1. KHM बफर निकालें और उचित कुओं (चित्रा 2, 1 टेबल) को प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (बकरी विरोधी साल्मोनेला CSA1-FITC, 250 μl / अच्छी तरह से, 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 15 मिनट के लिए थाली सेते हैं और 5% सीओ 2। 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धो 3x।
  7. फिक्सेशन।
    1. पीबीएस निकालें और पीबीएस में पीएफए ​​4% की 250 μl जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. कुओं पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ 2x धो लें और लगानेवाला बुझाने के लिए 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1 एम Glycine के 250 μl जोड़ें। धो कुओं पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ 2x।
  8. कुलसंक्रमित नमूनों की साल्मोनेला धुंधला हो जाना।
    1. धो 0.1% सैपोनिन / 3% BSA के साथ पीबीएस के साथ 3x coverslips और एक विरोधी CSA1 एंटीबॉडी के साथ नमूने सेते हैं 1 घंटे के लिए (बकरी विरोधी CSA1, 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल, माउस विरोधी LPs, 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल के रूप में अच्छी तरह से काम करता है) 0.1% सैपोनिन / 3% BSA के साथ पीबीएस में आरटी पर।
    2. 0.1% सैपोनिन / 3% BSA के साथ पीबीएस में धो 3x। अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए 0.1% सैपोनिन / 3% BSA के साथ पीबीएस में पसंद की फ्लोरोफोरे करने के लिए मिलकर एक माध्यमिक विरोधी बकरी एंटीबॉडी के साथ अपने नमूनों को सेते हैं।
    3. धो पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ 3x coverslips और DAPI (1.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ बढ़ते मध्यम में विश्लेषण के लिए coverslips माउंट।
  9. माइक्रोस्कोपी विश्लेषण।
    1. साइटोसोलिक साल्मोनेला (सकारात्मक विरोधी साल्मोनेला -FITC) और कुल साल्मोनेला (डबल सकारात्मक) (चित्रा 5) की गणना के द्वारा एक confocal खुर्दबीन के साथ डेटा मोल। Permeabilization नियंत्रण दिखाने चाहिए: गैर permeabilized कोशिकाओं, Calnexin के लिए कोई धुंधलाdigitonin-permeabilized कोशिकाओं और सैपोनिन-permeabilized कोशिकाओं के लिए PDI धुंधला के लिए taining (चित्रा 4)। वेल्स ए 4 और ए 5 साल्मोनेला धुंधला के लिए के रूप में आंतरिक नियंत्रण की सेवा करेंगे।

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Representative Results

चित्रा 1 और चित्रा 2 प्रोटोकॉल 1 और 2 प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम है और प्राप्त परिणामों illustrating में वर्णित digitonin परख के schematics दिखा। 3 ठेठ FACS के परिणामों से पता चलता है। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण mCherry / + FITC- बैक्टीरिया (vacuolar साल्मोनेला) और mCherry / + FITC + बैक्टीरिया (साइटोसोलिक साल्मोनेला) के लिए द्वार स्थापित करने के लिए किया जाता है। इन फाटकों के आधार पर साइटोसोलिक और vacuolar बैक्टीरिया का प्रतिशत प्रयोगात्मक नमूनों में निर्धारित किया जा सकता है। इस उदाहरण में हम जंगली प्रकार और ΔsifA साल्मोनेला की तुलना में है। चित्रा 3 mCherry + साल्मोनेला जंगली प्रकार और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न murine मैक्रोफेज में एक ΔsifA उत्परिवर्ती के साथ प्राप्त प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है। 4 चित्रा सामान्य Calnexin (ए) और PDI से पता चलता है (बी) permeabilization के नियंत्रण टी में प्राप्त किया जाता है कि धुंधलाdigitonin या सैपोनिन साथ reated। Calnexin एक ईआर झिल्ली प्रोटीन है, Calnexin धुंधला साइटोसॉल भर में और digitonin- और सैपोनिन-permeabilized कोशिकाओं दोनों में नाभिक के चारों ओर देखा जा सकता है। Digitonin में सैपोनिन-permeabilized कोशिकाओं में मनाया जा सकता है धुंधला हो जाना है, जबकि कोई पीडीआई धुंधला (लुमेन ईआर), दिख रहा है नियंत्रण permeabilized। चित्रा 5A digitonin साथ permeabilized किया गया है कि कोशिकाओं में विरोधी साल्मोनेला धुंधला परिणाम से पता चलता है। साइटोसोलिक बैक्टीरिया (विरोधी साल्मोनेला -FITC के साथ दाग) हरे रंग में हैं, जबकि कुल बैक्टीरिया, लाल रंग में हैं। FITC के नकारात्मक आबादी रिक्तिका (SCV) युक्त एक अक्षुण्ण साल्मोनेला में रहने वाले थे और इसलिए साल्मोनेला -FITC लेबलिंग से संरक्षित किया गया है कि बैक्टीरिया होते हैं, जबकि आबादी FITC पॉजिटिव, साइटोसॉल के उपयोग के साथ साल्मोनेला हैं। हम यह भी एक ΔsifA उत्परिवर्ती तनाव को जंगली प्रकार साल्मोनेला की तुलना में है। Sifa आवश्यक है के बाद से साल्मोनेला एस बनाए रखने के लिए के लिएसीवी अखंडता साल्मोनेला का एक बढ़ा प्रतिशत साइटोसोलिक है। चित्रा 5 ब में हम कोशिकाओं विरोधी साल्मोनेला -FITC जोड़ने से पहले permeabilized digitonin नहीं कर रहे थे, जिसमें एक नियंत्रण, दिखाते हैं। तदनुसार, कोई FITC पॉजिटिव बैक्टीरिया देखा जा सकता है।

चित्र 1
बरकरार रिक्तिकाएं या cytosol में या तो mCherry पॉजिटिव साल्मोनेला युक्त प्रोटोकॉल 1. संक्रमित कोशिकाओं के चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व विभिन्न digitonin साथ permeabilized कर रहे हैं। साइटोसोलिक साल्मोनेला FITC के लिए युग्मित विरोधी साल्मोनेला के साथ दाग रहे हैं। प्रकोष्ठों धोया और FACS विश्लेषण के लिए ट्राइटन X-100 के साथ lysed रहे हैं। सकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं को पूरी तरह एंटीबॉडी धुंधला से पहले permeabilized कर रहे हैं, जबकि नकारात्मक नियंत्रण कक्षों, permeabilized नहीं कर रहे हैं।

बरकरार रिक्तिकाएं या cytosol में या तो unlabeled साल्मोनेला युक्त प्रोटोकॉल 2. संक्रमित कोशिकाओं के चित्रा 2. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व विभिन्न digitonin साथ permeabilized कर रहे हैं। साइटोसोलिक साल्मोनेला FITC के लिए युग्मित विरोधी साल्मोनेला के साथ दाग रहे हैं। प्रकोष्ठों धोया और 4% पीएफए ​​के साथ तय कर रहे हैं। कोशिकाओं को पूरी तरह FITC / + Alexa568 + साल्मोनेला (साइटोसोलिक) और Alexa568 + साल्मोनेला (vacuolar) गिनती करने के लिए प्रयोग किया जाता है permeabilzed और एलेक्सा 568 माइक्रोस्कोपी के लिए युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा पीछा विरोधी साल्मोनेला एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं।

चित्र तीन
पूरी तरह से permeabilized, unpermeabilized या विभिन्न permeabilized नमूनों की चित्रा 3. FACS विश्लेषण mCherry + जंगली प्रकार या & # के साथ 6 घंटे के लिए संक्रमित916, 6 घंटा के लिए Sifa साल्मोनेला।

चित्रा 4
चित्रा 4. विरोधी Calnexin (ए) और असंक्रमित BMDMs के विरोधी पीडीआई (बी) धुंधला digitonin या सैपोनिन साथ permeabilized। स्केल सलाखों 10 माइक्रोन।

चित्रा 5
चित्रा 6 बजे साल्मोनेला जंगली प्रकार और ΔsifA उत्परिवर्ती तनाव के साथ एक अंतर है permeabilization के परख की 5. प्रतिनिधि छवियों के बाद संक्रमण। साइटोसोलिक साल्मोनेला और कुल साल्मोनेला संकेत कर रहे हैं। प्रकोष्ठों थे या तो साइटोसोलिक साल्मोनेला के लिए विरोधी साल्मोनेला -FITC के साथ धुंधला से पहले digitonin permeabilized (ए) या ​​छोड़ दिया unpermeabilized (बी)। इस धुंधला कदम, सी के बादएल Saponin साथ permeabilized थे और कुल साल्मोनेला माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला (लाल) द्वारा पीछा विरोधी साल्मोनेला एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। स्केल 10 माइक्रोन सलाखों।

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Discussion

विभेदक permeabilization के विश्लेषण और vacuolar डिब्बों और साइटोसॉल के बीच बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के subcellular वितरण यों के लिए एक आसान और मजबूत तरीका है। एक ही परख ऐसे Francisella novicida 2,4 और शिगेला flexneri 12 के रूप में बैक्टीरिया के साथ सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। कई इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ को बदलने या मेजबान एंडोमेम्ब्रेन संरचनाओं को संशोधित हालांकि, बाद से, digitonin permeabilization की मजबूती के एक व्यक्ति के आधार पर निर्धारित किया जाना होगा। आवश्यक हो सकता है इस्तेमाल किया रोगज़नक़ या सेल लाइन के संबंध में परख के ठीक ट्यूनिंग। परख सिर्फ संक्रमण जीव विज्ञान के लिए ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी कोशिका मृत्यु 17,18 संकेत की तरह है कि, अन्य सेल जैविक आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस परख करने के लिए महत्वपूर्ण विशेष इंट्रासेल्युलर झिल्ली कम चो होते में प्लाज्मा झिल्ली और intracellular झिल्ली, एक अलग लिपिड रचना हैlesterol। Digitonin जटिल कोलेस्ट्रॉल और इस तरह होता है permeabilization, digitonin उपचार की लंबाई और डिटर्जेंट की एकाग्रता पर निर्भर करता है जो की क्षमता और चयनात्मकता अंतर करने के लिए कर सकते हैं। इस के लिए नियंत्रित करने के लिए यह एक ऐसी calnexin के साइटोसोलिक पूंछ या ईआर luminal प्रोटीन PDI के रूप में परिभाषित किया इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण के साथ मार्कर प्रोटीन, के लिए धुंधला द्वारा permeabilized कोशिकाओं की जांच जरूरी है।

अंतर permeabilization के लिए नया नहीं है, इस प्रोटोकॉल के अलावा FACS के आधार पर साइटोसोलिक और vacuolar बैक्टीरिया की एक तेजी से और उद्देश्य मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। FACS विश्लेषण के लिए यह गैर permeabilized और पूरी तरह से permeabilized कोशिकाओं रहे हैं जो दो नियंत्रण, शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। बेदाग और पूरी तरह से सना हुआ यानी vacuolar और साइटोसोलिक बैक्टीरिया के लिए द्वार की स्थापना की जाएगी इन पर नियंत्रण के नमूने के आधार पर।

प्रोटोकॉल के एक महत्वपूर्ण कदम permeabilization और बाद में धोने कदम है। फादरeshly तैयार बफर और डिटर्जेंट समाधान के लिए इस्तेमाल किया जाना है। सभी समाधान बस का उपयोग करने से पहले तैयार होना चाहिए। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु permeabilization का समय है। यहाँ / एमएल अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज के लिए अच्छी तरह से काम करने के लिए 50 माइक्रोग्राम के digitonin एकाग्रता पर 1 मिनट साबित कर दिया है। अलग सेल लाइनों का उपयोग करते हैं, काम कर रहे एकाग्रता अनुभव से निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। 1 मिनट से अधिक digitonin या ऊष्मायन समय की उच्च सांद्रता आंतरिक झिल्ली, और झूठी सकारात्मक परिणाम की permeabilization के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। 2 घंटा - Digitonin समाधान 1 के लिए केवल स्थिर रहे हैं। बस से पहले digitonin की एक ताजा समाधान की तैयारी पूरी तरह से गंभीर है। इसके अलावा digitonin की क्षमता झिल्ली बैच से बैच के लिए और अलग अलग आपूर्तिकर्ताओं के बीच भिन्न हो सकते हैं permeabilze करने के लिए।

कई नमूने इलाज की जरूरत है इसलिए अगर यह आसानी से और तेजी से कार्रवाई की जा सकती है कि छोटे समूहों में इन विभाजित करने के लिए सलाह दी जाती है। पर्म के बाद अंत में, सभी धोने कदमdigitonin उपचार सेलुलर झिल्ली को कमजोर के बाद से eabilization बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए। बफर और आकांक्षा की वृद्धि अच्छी तरह से बीच में धीरे अच्छी तरह के पक्ष में नहीं है और किया जाना चाहिए।

ने बताया, अन्य तकनीकों संवाददाता CCF4-पूर्वाह्न 19 झल्लाहट साइटोसॉल और इस तरह के बी-लैक्टामेज़ दरार का प्रयोग के रूप में vacuolar डिब्बों मौजूद हैं, के बीच बैक्टीरिया के subcellular वितरण का विश्लेषण करने के लिए। CCF4-पूर्वाह्न विधि वास्तविक समय में vacuolar टूटना मापने का लाभ प्रदान करते हैं, यह एक जीवाणु के स्तर पर संकल्प का अभाव है और केवल एक मेजबान कोशिका के स्तर के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। इस प्रकार दोनों assays के संयोजन के समय के साथ ही बैक्टीरिया / मेजबान कोशिकाओं के स्तर के बारे में जानकारी हासिल करने के लिए आदर्श है। महत्वपूर्ण बात है, दोनों assays के जीवाणु संक्रमण के संदर्भ में, लेकिन यह भी लक्ष्य पी के उप सेलुलर स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए उद्देश्य है कि अन्य सेल जैविक अध्ययन के संदर्भ में ही इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है18 roteins।

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Acknowledgments

हम चर्चा के लिए मैथियास एस डिक, रोलाण्ड एफ Dreier और सेबस्टियन RUHL स्वीकार करना चाहते हैं। यह काम एक SNSF प्रोफेसरशिप PP00P3_139120 / 1 और पंजाब के लिए एक विश्वविद्यालय बासेल की परियोजना अनुदान ID2153162 द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digitonin Sigma D5628 50 μg/ml
PFA mpbio 219998380
HEPES Life Technologies 15630
Potassium Acetate Sigma 791733
MgCl2 Sigma M8266
BSA Sigma A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC KPL 01-91-99-MG 1/500
anti-Salmonella CSA-1 KPL 02-91-99-MG 1/500
anti-Calnexin Enzo Lifesciences SPA-860D 1/100
anti-PDI Enzo Lifesciences SPA-890 1/100
Saponin Sigma 47036
Vectashield mounting medium Vectorlabs H-1200
Anti Rabbit antibody-488 Molecular Probes A-11070 1/500
Glycine Sigma G8898
Gentamicin Life Technologies 15710-49 100 μg/ml and 10 μg/ml
Triton X-100 Promega H5141
PBS Gibco 20012-019
DMEM Sigma D6429
NEAA Amimed 5-13K00-H
LSM700 Confocal microscope Zeiss imaging done at 63X
FACS Fortessa BD technologies detection mCherry 610 nm
FACS Fortessa BD technologies detection FITC 530 nm

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References

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Meunier, E., Broz, P. Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization. J. Vis. Exp. (101), e52960, doi:10.3791/52960 (2015).

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