Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

Summary

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Abstract

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Introduction

Сосудистый эндотелий является не только барьерный слой , который отделяет кровь и ткани, считается обширную эндокринную железу , которая простирается по всей сосудистой сети с площадью поверхности 400 квадратных метров ^1. Благополучие эндотелия имеет важное значение для сосудистого гомеостаза. Дисфункциональной эндотелий участвует в различных сердечно – сосудистых заболеваний, в том числе атеросклероз, васкулит и ишемия / реперфузии травм и т.д. ^2-4. На сегодняшний день конкретные клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в этих условиях болезни недостаточно хорошо изучены в связи с рассеянным анатомического характера эндотелий.

Мышь является важной моделью для исследования, поскольку генетические методы манипуляции более развиты, чем у мышей в любых других видов млекопитающих. Тем не менее, выделение первичных мышиных эндотелиальных клетках аорты считается особенно трудным, потому что малый размер аорты составляет enzymatIC переваривание эндотелий непрактичным. Некоторые из них сообщили процедуры для выделения и очистки КЭ требуют ^5-7.

Целью этого протокола является использование простой метод, чтобы изолировать и расширить эндотелиальные клетки из аорты мыши без использования какого-либо специального оборудования. В этом протоколе, свежеизолированные аорту разрезают на небольшие сегменты и высевали на матрицу с эндотелием, обращенной вниз, чтобы позволить эндотелиальной всходов. После того, как сегменты будут удалены, эндотелиальные клетки разлагаются в эндотелий благоприятствования среде и готовы к экспериментам после двух или трех проходов. Преимущества описанного способа является то, что: 1) значительно большое число эндотелиальных клеток собирают из одной аорты; 2) жизнеспособность клеток хорошо сохраняется; и 3) никакого специального оборудования или техника не требуется. Это обеспечивает эффективное средство идентификации специфических клеточных и молекулярных механизмов в клеточной патофизиологии эндотелиальной. Для тех, кто заинтересован в изучении прimary культивируемые эндотелиальные клетки либо из генов мышей нокаут, ген нокаут у мышей, или мышиной модели заболевания, этот протокол является очень полезным и легко практиковать.

Protocol

1. Выделение аорте мышей Все процедуры, описанные здесь, были утверждены Институциональный животных по уходу и использованию комитета Wayne State University по. Поместите мышь в индукционную камеру анестезии машины. Установите поток изофлуран до 4% в сочетании с 25% свежего во…

Representative Results

Эндотелиальные клетки Проращивание Спонтанное эндотелиальные клетки всходов начинается с сегмента мыши аорты. Сегмент мыши аорту позволяли расти на фактор-редуцированной матрицы роста затем в среде роста эндотелиальных клеток в течение 4-х дней. Ячейка прора…

Discussion

Это исследование демонстрирует простой метод, чтобы изолировать и культуры эндотелиальных клеток из аорты мыши без какого-либо специального оборудования. Иммунофлюоресценции окрашивание показало, что большинство клеток были эндотелиальные клетки после второго прохода. Предполагае…

Materials

4- or 6-week-old mice (Jackson Laboratory, #000664).

Sterile 1X phosphate-buffered saline (PBS, Gibco, #10010-023).

Sterile 1X PBS containing 1,000 U/ml of heparin (Sigma Aldrich, H3149).

Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium[DMEM] with 25mM HEPES[Gibco, #12320-032 ], supplemented with 100μg/ml endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma,#2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/ml heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000U/ml penicillin and 10mg/ml streptomycin [Gibco, #15140-122]).

Growth factor reduced matrix (BD Biosciences, #356231).

Neutral proteinase (Dispase, 1U/ml, Fisher Scientific #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034g/L[Sigma, #1255], in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose[Gibco, #12320-032 ]).

Gelatin (100‑200 μg/cm2, Sigma, #G1393).

1,1`-dioctadecyl-3,3,3`,3`- tetramethylindo- carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL, Life Technologies, #L3484),  FITC-labeled Ulex europeus agglutinin (Ulex-Lectin, Sigma, #L9006),  Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody (BD Biosciences, # 553372).

Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody (Cell signaling, #9698), anti-mouse endothelial nitric oxide synthase (Abcam, #ab5589), anti-mouse vascular endothelium-cadherin (Abcam, #33168), anti-mouse calponin (Abcam, #700), FITC-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma, #F6005)

One ml syringe fitted with 25-G needle (Fisher Scientific, #50-900-04222).

100mm Peri dishes (Fisher Scientific,  #07-202-516).

Six-well cell culture plates (Fisher Scientific, #08-772-1B).

T12.5 cultuer flask (Fisher Scientific, #50-202-076)

Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade (Fine Science Tools, Inc)

Anesthesia machine with isoflurane (Webster Veterianary Supply, #07-806-3204), heating lamp

Centrifuge machine.

Inverted phase-contrast microscope.

inverted fluorescence microscope.