Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

Summary

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Abstract

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Introduction

Det vaskulära endotelet inte bara är ett barriärskikt som separerar blod och vävnad, anses det vara en stor endokrin körtel som sträcker sig över hela det vaskulära trädet med en ytarea av 400 kvadratmeter ^1. Den välmående endotelet är avgörande för vaskulär homeostas. Den dysfunktionella endotel deltar i olika kardiovaskulära sjukdomar, inklusive åderförkalkning, vaskulit och ischemi / reperfusionsskador, etc. ^2-4. Hittills har de specifika cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i dessa sjukdomar inte förstått på grund av den diffusa anatomiska natur endotel.

Musen är en viktig modell för forskning eftersom genetiska manipulationstekniker är mera utvecklade i möss än i någon annan däggdjursart. Emellertid är isoleringen av primära murina aortaendotelceller anses särskilt svårt eftersom den lilla storleken av aortan gör enzymatic digerering av endotel opraktisk. Några rapporterade förfaranden för att isolera och rena EC kräver ^5-7.

Målet med detta protokoll är att använda en enkel metod för att isolera och expandera endotelceller från mus aorta utan att använda någon speciell utrustning. I detta protokoll är nyligen isolerade aorta skärs i små segment och såddes på en matris med endotel nedåt för att möjliggöra endotel groning. Efter segment tas bort, är endotelceller expanderas i endotel gynnade medium och är redo för experiment efter två eller tre passager. Fördelarna med den beskrivna metoden är att: 1) avsevärt stort antal endotelceller skördas från en enda aorta; 2) cellviabiliteten är välbevarad; och 3) Det behövs ingen speciell utrustning eller teknik. Det ger ett effektivt sätt att identifiera specifika cellulära och molekylära mekanismer i endotelceller patofysiologi. För dem som är intresserade av att studera primary odlade endotelceller från antingen gen knock-out-möss, knock-i möss, eller en mus sjukdomsmodell, är genen detta protokoll mycket användbar och lätt att träna.

Protocol

1. Isolering av Aorta från möss Alla de förfaranden som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av Wayne State University. Placera musen i induktionskammaren av anestesiapparaten. Ställ in isofluran flödet till 4% i samband med 25% frisk luft och 75% O2. Söva musen genom inandning av isofluran (4% för induktion, ± 1,0% för underhåll) i samband med 25% frisk luft och 75% O 2 via induktionskammare, …

Representative Results

Endothelial Cell Sprouting Spontan endotelceller groning startade från en mus aorta segment. Musen aorta segmentet tilläts växa på en tillväxtfaktor-reducerad matris sedan i endotelcell-tillväxtmedium i 4 dagar. Endotelceller groning uppträder vanligen i 2 – 4 dagar. Mikrofotografier togs på dag 4 (Figur 1). Såsom visas i bilderna, talrika endotelceller migrera bort från segmentet. De nybildade groddar fortsätter att sträcka sig från segmentet o…

Discussion

Denna studie visar en enkel metod för att isolera och kultur endotelceller från en mus aorta utan någon särskild utrustning. Den immunofluorescensfärgning indikerade att majoriteten av celler var endoteliala celler efter den andra passagen. Det föreslås att celler vid andra till tredje passage är lämpliga för in vitro- och in vivo-experiment för att studera endotelial biologi.

Nyckeln Anteckningar från detta protokoll

<p class="jove_content"…

Materials

4- or 6-week-old mice (Jackson Laboratory, #000664).

Sterile 1X phosphate-buffered saline (PBS, Gibco, #10010-023).

Sterile 1X PBS containing 1,000 U/ml of heparin (Sigma Aldrich, H3149).

Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium[DMEM] with 25mM HEPES[Gibco, #12320-032 ], supplemented with 100μg/ml endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma,#2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/ml heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000U/ml penicillin and 10mg/ml streptomycin [Gibco, #15140-122]).

Growth factor reduced matrix (BD Biosciences, #356231).

Neutral proteinase (Dispase, 1U/ml, Fisher Scientific #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034g/L[Sigma, #1255], in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose[Gibco, #12320-032 ]).

Gelatin (100‑200 μg/cm2, Sigma, #G1393).

1,1`-dioctadecyl-3,3,3`,3`- tetramethylindo- carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL, Life Technologies, #L3484),  FITC-labeled Ulex europeus agglutinin (Ulex-Lectin, Sigma, #L9006),  Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody (BD Biosciences, # 553372).

Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody (Cell signaling, #9698), anti-mouse endothelial nitric oxide synthase (Abcam, #ab5589), anti-mouse vascular endothelium-cadherin (Abcam, #33168), anti-mouse calponin (Abcam, #700), FITC-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma, #F6005)

One ml syringe fitted with 25-G needle (Fisher Scientific, #50-900-04222).

100mm Peri dishes (Fisher Scientific,  #07-202-516).

Six-well cell culture plates (Fisher Scientific, #08-772-1B).

T12.5 cultuer flask (Fisher Scientific, #50-202-076)

Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade (Fine Science Tools, Inc)

Anesthesia machine with isoflurane (Webster Veterianary Supply, #07-806-3204), heating lamp

Centrifuge machine.

Inverted phase-contrast microscope.

inverted fluorescence microscope.