We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.
The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.
Сосудистые заболевания, такие как церебральный вазоспазм 1,2, гипертонии 3 и 4, атеросклероза развиваются медленно, как правило, хронический характер, и привлечь неблагополучных силы поколения сосудистыми гладкомышечных клеток (VSMCs). Мы стремимся, чтобы изучить эти медленно прогрессирующее-сосудистых дисфункций, используя в пробирке методами с более точного управления экспериментальных условиях, чем в естественных условиях модели в. Ранее мы уже разработаны сосудистые мышечные тонкие пленки (vMTFs) для измерения функциональной сократительной в пробирке инженерии тканей сердечно-сосудистых 5, но этот способ был ограничен относительно краткосрочные исследования. Здесь мы представляем технику модификации субстрата, который расширяет наш предыдущий метод vMTF для долгосрочных измерений.
В то время как эндотелий также имеет важное значение в общей сосудистой функции, разработаны артериальной ламели обеспечивают полезную модель системы оценки изменения в сосудистойсократимость во прогрессирования заболевания. Чтобы сконструировать функциональную модель сосудистых заболеваний тканей, как структуру и функцию артериальной ламели, основной единицей сократительного сосуда, должна быть воспроизводятся с высокой точностью. Артериальная ламели представляют собой концентрические окружности, выровненный листы сократительных VSMCs разделенных листов эластина 6. Микроконтактной печати внеклеточного матрикса (ЕСМ) белки на полидиметилсилоксановых (PDMS) подложках ранее использовались, чтобы обеспечить сигналы наведения для тканевой организации, чтобы имитировать выровнены сердечно-сосудистой ткани 5,7-10. Тем не менее, ткани с рисунком, используя микроконтактной печати может потерять целостность после 3-4 дней в культуре, что ограничивает их применимость в длительных исследованиях. Этот протокол обеспечивает решение этой проблемы путем замены предыдущих методов микроконтактная печати с новой техникой микрофлюидного осаждения.
Генчи др. Модифицированные PDMS субстраты с генипин и Fкруглый продлен жизнеспособность миоцитов до одного месяца в культуре 11. Здесь мы используем аналогичный подход, чтобы расширить культуру рисунком гладкомышечных клеток сосудов ПДМС. Генипин, естественно гидролитической производное гардении фруктов, является желательным кандидатом для модификации подложки из-за его относительно низкой токсичности по сравнению с аналогичными сшивающих агентов и его более широкое использование в качестве биоматериала в области восстановления тканей 12,13 и модификации ECM 14, 15. В этом протоколе, фибронектин используется в качестве ячейки наведения команде, как и в предыдущих методов микроконтактная печати; Однако, генипин осаждается на подложках PDMS до фибронектина паттерна. Таким образом, как клетки деградируют в узорной матрицу, вновь синтезированный ЕСМ из прилагаемых VSMCs может связываться с генипин покрытием PDMS подложки.
Этот протокол использует микрожидкостных доставки устройство для двухступенчатой генипин и осаждения ECM. Дизайн микрожидкостных имитирует устройство microcontact модели печатные, используемые для инженерных артериальной ламелей в предыдущих исследованиях 16. Таким образом, мы ожидаем, что этот протокол для получения артериальной ламели имитирует, что успешно воспроизводят высоко выровнены в структуре естественных и сократительной функции артериальной ламелей. Мы также оценить сократительную ткань, чтобы подтвердить, что это генипин подходит модификация субстрата соединение для долгосрочного в пробирке моделей сосудистых заболеваний.
Здесь мы приводим протокол, который строит на ранее разработанной технологии vMTF, позволяя расширенные раз эксперимент более характерно хронических сосудистых заболеваний путей 1,23,24. Чтобы достичь этого, мы micropattern генипин, который ранее было показано, чтобы обеспечить долговрем?…
The authors have nothing to disclose.
We acknowledge financial support from the American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) and the University of Minnesota Doctoral Dissertation Fellowship (ESH). We also acknowledge the microfabrication resources of the Minnesota Nano Center (MNC) and the image processing resources of the University Imaging Centers (UIC), both at the University of Minnesota. Parts of this work were carried out in the Characterization Facility, University of Minnesota, which receives partial support from NSF through the MRS program.
Coverslip staining rack | Electron Microscopy Sciences | www.emsdiasum.com/ | 72239-04 | Alternative coverslip rack may be used |
Microscope cover glass – 25 mm | Fisher Scientific, Inc. | www.fishersci.com | 12-545-102 | Alternative brand and size may be used; Microscope slides may also be substituted as substrate base |
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Polysciences, Inc. | www.polysciences.com/ | #21458 | Sigma-Aldrich makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol; Compound gives strong odor, use proper ventilation |
1-butanol | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | 360465 | Hazard: flammable (store stock solution in flammable cabinet); flash point is 37 °C, avoid heating; alternative product may be used |
Spincoater | Specialty Coating Systems, Inc. | www.scscoatings.com | SCS G3P8 Model; Alternative brand and/or model may be used | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Alternative distributor may be used |
Fluorescent microbeads | Polysciences, Inc. | www.polysciences.com/ | 17151 | Alternative brand and/or larger size may be used |
Silicon wafers | Wafer World, Inc. | www.waferworld.com | 2398 | Alternative brand and/or size may be used |
Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | SU-8 3025 allows 20-25-µm feature height | |
Contact mask aligner | Suss MicroTec | www.suss.com | MA6 contact mask aligner; alternative brand and/or model may be used for wafer exposure | |
Developer | MicroChem Corp. | www.microchem.com | SU-8 Developer; Hazard: flammable | |
Tridecafluro-trichlorosilane | UCT Specialties, Inc. | www.unitedchem.com | T2492 | Silane for non-stick coating of patterned silicon wafers (CAUTION: Tridecafluro-trichlorosilane is a flammable and corrosive liquid. Proper personal protective equipment and local exhaust is necessary for use. ) |
Surgical biopsy punch | Integra LifeSciences Corp. | www.miltex.com | 33-31AA-P/25 | Alternative brand and/or size may be used |
Genipin | Cayman Chemical | www.caymanchem.com | 10010622 | Sigma-Aldrich (G4796-25MG) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol |
1X phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | www.cellgro.com | 21-031-CV | Alternative brand may be used |
Fibronectin | Corning, Inc. | www.corning.com | 356008 | Sigma-Aldrich (F1056) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Inc. | www.lifetechnologies.com | 15140-122 | Alternative brand and/or size may be used, as long as concentration is the same |
Umbillical artery smooth muscle cells | Lonza | www.lonza.com | CC-2579 | Alternative cell types may be used for alternative applications. Media should be modified accordingly |
Tyrode's solution components | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | various | Alternative brand may be used for mixing solution |
Stereomicroscope | Zeiss | www.zeiss.com | 4350020000000000 | SteREOLumar V12; Alternative brand/type of stereomicroscope may be used |
Temperature-controlled platform | Warner Instruments | www.warneronline.com | 641659; 640352; 641922 | |
Endothelin-1 | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | E7764-50UG | Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained |
HA-1077 | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | H139-10MG | Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained |