We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.
The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.
Vaskulära sjukdomar, såsom cerebral vasospasm 1,2, hypertoni 3 och ateroskleros 4, utvecklas långsamt, är typiskt kronisk karaktär, och involverar dysfunktionella kraft-generering av vaskulära glatta muskelceller (VSMC). Vi strävar efter att studera dessa långsamt progredierande kärl dysfunktioner använder in vitro-metoder med bättre kontroll av experimentella betingelser än i in vivo-modeller. Vi har tidigare utvecklat kärlmuskel tunna filmer (vMTFs) för mätning av funktionella kontraktilitet av in vitro konstruerade kardiovaskulära vävnader 5, men denna metod har varit begränsad till relativt korttidsstudier. Här presenterar vi ett substrat modifiering teknik som utökar vår tidigare vMTF teknik för långtidsmätningar.
Medan endotel är också avgörande för övergripande kärlfunktionen, konstruerad arteriell lameller ger ett användbart modellsystem för bedömning av förändringar i vaskulärkontraktilitet under sjukdomsprogression. För att konstruera en funktionell kärlsjukdom vävnadsmodell, både struktur och funktion av artärlamellen, den grundläggande kontraktila enhet av fartygets måste rekapituleras med high fidelity. Arterial lameller är koncentriska, periferiellt inriktade ark kontraktila VSMC åtskilda av ark av elastin 6. Mikrokontakttryckning av extracellulärt matrix (ECM) proteiner på polydimetylsiloxan (PDMS) substrat har tidigare använts för att tillhandahålla vägledning ledtrådar för vävnadsorganisation för att efterlikna i linje kardiovaskulär vävnad 5,7-10. Men vävnader mönstrad med hjälp microcontact utskrift kan förlora integriteten efter 3-4 dagar i kultur, vilket begränsar deras användbarhet i kroniska studier. Detta protokoll ger en lösning på denna fråga genom att ersätta tidigare microtrycktekniker med en ny mikroflödesavsättningsteknik.
Genchi m.fl.. Modifierade PDMS substrat med genipin och found långvarig livskraft myocyter upp till en månad i kultur 11. Här använder vi en liknande strategi att utöka kultur av mönstrade vaskulära glatta muskelceller på PDMS. Genipin, en naturlig hydrolytisk derivat av gardenia frukt, är en önskvärd kandidat för substrat ändring på grund av dess relativt låg toxicitet jämfört med liknande tvärbindningsmedel och dess ökande användning som biomaterial inom vävnadsreparation 12,13 och ECM ändring 14, 15. I detta protokoll, är fibronektin utnyttjas som en cell vägledning kö, som i tidigare microtryckmetoder; dock genipin avsätts på PDMS substrat före fibronektin mönstring. Således, som celler försämra mönstrade matrisen, kan nysyntetiserade ECM från anslutna VSMC binda till genipin belagda PDMS substrat.
Detta protokoll använder en mikroflödes avgivningsanordning för två-stegs genipin och ECM nedfall. Utformningen av mikrofluidikanordning härmar microcontact tryckmönster som används för konstruerade arteriell lameller i tidigare studier 16. Därför räknar vi med detta protokoll för att ge arteriell lameller härmar som framgångsrikt rekapitulera den högt linje in vivo struktur och sammandragande funktion av arteriell lameller. Vi utvärderar också vävnads kontraktilitet att bekräfta att genipin är ett lämpligt substrat modifikation förening för långsiktig in vitro modeller kärlsjukdom.
Här presenterar vi ett protokoll som bygger på tidigare utvecklat vMTF teknik, vilket gör att långa experiment gånger mer typiska för kronisk kärlsjukdom vägar 1,23,24. För att åstadkomma detta, micropattern vi genipin, som tidigare har visat sig ge långsiktig funktionalisering av PDMS-substrat 11, med användning av ett mikrofluidavsättningsteknik för erhållande av Engineered arteriell lameller med förbättrad vaskulär vävnadsviabilitet för användning i MTF kontraktilitet experi…
The authors have nothing to disclose.
We acknowledge financial support from the American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) and the University of Minnesota Doctoral Dissertation Fellowship (ESH). We also acknowledge the microfabrication resources of the Minnesota Nano Center (MNC) and the image processing resources of the University Imaging Centers (UIC), both at the University of Minnesota. Parts of this work were carried out in the Characterization Facility, University of Minnesota, which receives partial support from NSF through the MRS program.
Coverslip staining rack | Electron Microscopy Sciences | www.emsdiasum.com/ | 72239-04 | Alternative coverslip rack may be used |
Microscope cover glass – 25 mm | Fisher Scientific, Inc. | www.fishersci.com | 12-545-102 | Alternative brand and size may be used; Microscope slides may also be substituted as substrate base |
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Polysciences, Inc. | www.polysciences.com/ | #21458 | Sigma-Aldrich makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol; Compound gives strong odor, use proper ventilation |
1-butanol | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | 360465 | Hazard: flammable (store stock solution in flammable cabinet); flash point is 37 °C, avoid heating; alternative product may be used |
Spincoater | Specialty Coating Systems, Inc. | www.scscoatings.com | SCS G3P8 Model; Alternative brand and/or model may be used | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Alternative distributor may be used |
Fluorescent microbeads | Polysciences, Inc. | www.polysciences.com/ | 17151 | Alternative brand and/or larger size may be used |
Silicon wafers | Wafer World, Inc. | www.waferworld.com | 2398 | Alternative brand and/or size may be used |
Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | SU-8 3025 allows 20-25-µm feature height | |
Contact mask aligner | Suss MicroTec | www.suss.com | MA6 contact mask aligner; alternative brand and/or model may be used for wafer exposure | |
Developer | MicroChem Corp. | www.microchem.com | SU-8 Developer; Hazard: flammable | |
Tridecafluro-trichlorosilane | UCT Specialties, Inc. | www.unitedchem.com | T2492 | Silane for non-stick coating of patterned silicon wafers (CAUTION: Tridecafluro-trichlorosilane is a flammable and corrosive liquid. Proper personal protective equipment and local exhaust is necessary for use. ) |
Surgical biopsy punch | Integra LifeSciences Corp. | www.miltex.com | 33-31AA-P/25 | Alternative brand and/or size may be used |
Genipin | Cayman Chemical | www.caymanchem.com | 10010622 | Sigma-Aldrich (G4796-25MG) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol |
1X phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | www.cellgro.com | 21-031-CV | Alternative brand may be used |
Fibronectin | Corning, Inc. | www.corning.com | 356008 | Sigma-Aldrich (F1056) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Inc. | www.lifetechnologies.com | 15140-122 | Alternative brand and/or size may be used, as long as concentration is the same |
Umbillical artery smooth muscle cells | Lonza | www.lonza.com | CC-2579 | Alternative cell types may be used for alternative applications. Media should be modified accordingly |
Tyrode's solution components | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | various | Alternative brand may be used for mixing solution |
Stereomicroscope | Zeiss | www.zeiss.com | 4350020000000000 | SteREOLumar V12; Alternative brand/type of stereomicroscope may be used |
Temperature-controlled platform | Warner Instruments | www.warneronline.com | 641659; 640352; 641922 | |
Endothelin-1 | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | E7764-50UG | Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained |
HA-1077 | Sigma-Aldrich | www.sigmaaldrich.com | H139-10MG | Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained |