En trombotisk stroke modell baserad på gående cerebral hypoxi-ischemi
Summary
Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.
Abstract
Stroke forskning har uthärdat många motgångar i översätta neuroprotektiva terapier i klinisk praxis. Däremot verkliga terapi (tPA trombolys) ger sällan fördelar i mekaniska ocklusion baserade experimentella modeller, som dominerar preklinisk strokeforskning. Denna uppdelning mellan bänken och säng föreslår behovet av att anställa tPA-responsiva modeller i preklinisk strokeforskning. För detta ändamål är en enkel och tPA-reaktivt trombotisk stroke modell uppfunnits och beskrivs här. Denna modell består av övergående ocklusion av den ensidiga gemensamma halspulsådern och leverans av 7,5% syre genom en ansiktsmask i vuxna möss under 30 min, medan djuret rektaltemperatur upprätthölls vid 37,5 ± 0,5 ° C. Även reversibel ligering av den ensidiga halspulsådern eller hypoxi varje undertryckt cerebralt blodflöde endast övergående, en kombination av båda förolämpningar orsakat bestående reperfusion underskott, fibrin och avsättning av trombocyter, och stora INFARct i arteria cerebri media-supplied territorium. Viktigt är svans-ven injektion av rekombinant tPA vid 0,5, 1, eller 4 h efter Thi (10 mg / kg) gav tidsberoende minskning av dödligheten och infarktstorlek. Denna nya stroke Modellen är enkel och kan standardiseras över laboratorier för att jämföra experimentella resultat. Vidare inducerar det trombos utan craniectomy eller införa förformade emboli. Med tanke på dessa unika meriter, är thi modellen ett bra komplement till den repertoar av preklinisk strokeforskning.
Introduction
Trombolys och omkanalisering är den mest effektiva terapin av akut ischemisk stroke i klinisk praxis 1. Ändå var de flesta av preklinisk neuroprotektion forskning utförd i en övergående mekaniker hinder modell (intraluminal sutur mitten cerebral artärocklusion) som producerar snabb återhämtning av cerebralt blodflöde vid avlägsnande av vaskulär ocklusion och visar lite att några fördelar av tPA trombolys. Det har föreslagits att den tvivelaktiga valet av stroke modeller bidrog åtminstone delvis, till svårigheten att översätta neuroprotektiv terapi till patienter 2,3. Därför finns det ett ökande intresse för att anställa tPA-responsiva tromboemboliska stroke modeller inom preklinisk forskning, men sådana modeller har också tekniska problem (se diskussion) 4-7. Här beskriver vi en ny trombotisk stroke modell baserad på unilaterala gående hypoxisk-ischemisk (THI) förolämpning och dess svar på intravenös tPA behandling 8.
Thi stroke modell har utvecklats baserat på Levine förfarandet (permanent ligation av den ensidiga gemensamma halspulsådern, följt av exponering för övergående syrebrist i en kammare) som uppfanns för experiment med vuxna råttor 1960 9. Den ursprungliga Levine förfarande bleknat i glömska eftersom det bara producerade variabel hjärnskador, men samma förolämpning orsakade konsekvent neuropatologi i gnagare ungar när det återinfördes av Robert Vannucci och hans kollegor som en modell för neonatal hypoxisk-ischemisk encefalopati (HIE) 1981 10. Under de senaste åren, en del utredare åter anpassat Levine-Vannucci modell vuxna möss genom att justera temperaturen i hypoxisk kammaren 11. Det är troligt att de inkonsekventa hjärnskador i den ursprungliga Levine förfarandet kan uppstå från fluktuerande kroppstemperatur av vuxna gnagare i hypoxisk kammaren. För att testa denna hypotes, ändrade vi Levine förfarande genom att administrera hypoxisk gasgenom en ansiktsmask, medan gnagare kärntemperatur vid 37 ° C bibehållande på operationsbordet 12. Som väntat, stringent kroppstemperaturreglering ökade kraftigt reproducerbarheten för Hl-inducerad hjärn patologi. HI förolämpning utlöser också koagulering, autophagy och grå- och vita saken skada 13. Andra forskare har också använt Hl modell för att undersöka post-stroke inflammatoriska svar 14.
En unik egenskap hos HI stroke modellen är att den noga följer Virchow triad av blodproppsbildning, inklusive stasis av blodflödet, endotelskada (t.ex. på grund av HI-inducerad oxidativ stress), och hyperkoagulering (HI-inducerad trombocytaktivering) ( Figur 1A) 15. Som sådan, kan HI modellen fånga några patofysiologiska mekanismer som är relevanta för verkliga ischemisk stroke. Med denna idé i åtanke, ytterligare förfinat vi HI modell med reversibel ligering av FNilateral gemensamma halspulsådern (därför att skapa en övergående HI förolämpning), och testade sina svar till tPA trombolys med eller utan Edaravone. Edaravone är en fria radikaler som redan har godkänts i Japan för behandling av ischemisk stroke inom 24 timmar av starten 9. Våra experiment visade att så kort som 30 minuter övergående HI utlöser trombotisk infarkt, och som kombinerade tPA-Edaravone behandling ger synergieffekter 8. Här beskriver vi detaljerade kirurgiska ingrepp och metodologiska överväganden Thi modellen, som kan användas för att optimera reperfusion behandling av akut ischemisk stroke.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stroke är en viktig hälsofråga av växande betydelse för ett samhälle med en åldrande befolkning. Globalt sett är stroke den näst vanligaste dödsorsaken med uppskattningsvis 5,9 miljoner dödliga händelser under 2010, vilket motsvarar 11,1% av alla dödsfall 18. Stroke är också den tredje vanligaste orsaken till funktionsjusterade levnadsår (DALY) förlorade globalt under 2010, stiger upp ur femte plats 1990 19. Dessa epidemiologiska data understryker behovet av mer effektiva behandlin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the NIH grant NS074559 (to C. K.). We thank all collaborators who contributed to our research articles that the present methodology report is based upon.
Materials
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~13 weeks old (22~30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in-vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in-vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in-vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-braina imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 |
References
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research–advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3. r. d., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow’s triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed–specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
